Biochemie (Fach) / C (Lektion)

Biochemie C Praktikum Uni Wien, Rechtschreibfehler nicht ausgebessert.

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• Warum wird bei starken Verdünnungen der Rinderleberkatalase ein Puffer mit BSA verwendet? Bei starker Verdünnung neigen die Proteine dazu an der Glaswand haften zu bleiben. Gibt man zunächst Puffer + BSA zu werden die Bindungsstellen durch BSA besetzt und das Protein bleibt in Lösung
• Ordnen Sie die nachfolgenden Proteindenaturierungsmittel nach ihrer Effektivität: ho-her Druck, hohe Temperatur, pH 2,5 , Harnstoff, SDS   Δ pH > GdmCl > Harnstoff > SDS > Temperaturerhöhung >Druckerhöhung Ph-Ds gehen Pipi. Halten die luft im warmen raum an und drücken fester. ph (ionisation, schwach saurer bzw. basischer Seitenketten im inneren globulärer ProteineHarnstoff und gdmcl brechen wasserstrukturen auf und binden präferentiell an Proteinoberfläche
• Erklären Sie kurz, was man unter einem 2-Zustandsmodell der Entfaltung von Protei-nen versteht. 2-Zustandsmodell der Entfaltung: in 1. Näherung: herrscht ein direktes Gleichgewicht zwischen dem gefalteten (nativen) Zustand F und dem völlig entfalteten Zustand U: F<->U Die Lage dieses GW in Abwesenheit denaturierender Einflüsse, beschrieben durch Kaqu bzw. Δ Gaqu ist ein Maß für die konformationelle Stabilität des individuellen Protein und somit von großer praktischer Bedeutung. Wenn es sich um einen strengen 2-Zustandprozess handelt, ist dieser von der Wahl des Denaturierungsmittels unabhängig (da die beiden Zustände ja eindeutig definiert sind). Die (Nicht) Übereinstimmung von mit verschiedenen Methoden erhaltenen Denaturierungsisothermen ist daher eine Kontrolle für die Richtigkeit der obigen Annahme (Abweichungen meist bei Multi-Domänen- oder oligomeren Proteinen). Diagramm zu 2-Zustandsfall siehe F-7
• Wie groß ist die relative Stabilität des nativ gefalteten Zustands im Vergleich zum völlig entfalteten Zustand für typische Proteine mittlerer Größe? Was bedeutet dieser Wert in Relation zu den energetischen Beiträgen typischer nicht-kovalenter Wechselwrikung in Proteinen? energetische Unterschied zwischen kompakt gefaltet und völlig entfaltet delikate Balance zwischen stabil/destabilisierenden Effekten--> entropische Effekte dominieren Positive WW ( Trans WW innerhalb des Proteins) stehen negativen Effekten gegenüber ( ENtropiezunahme, verhinderte WW) Gesamtstabilität von Proteinen liegt zumeist in der Größenordnung 10-80kJ/mol. Dieser Wert entspricht etwa dem hydrophoben Effekt des Verbergens einiger weniger apolaren Seitenketten vor dem Lösungsmittel. Nicht zuletzt deswegen ist die energetische Berechnung von unbekannten Proteinstrukturen ein sehr problematisches Unterfangen. (F-1)
• Welcher unmittelbar aus einer Entfaltungsisotherme ablesbarer Parameter gibt ein recht brauchbares Maß für die Stabilität eines Proteins? Die Konzentration X1/2 ist eine charakteristische Größe und ein recht brauchbares Maß für den Vergleich der Stabilitäten verschiedener Proteine. X1/2 ist die zugehörige Konzentration am Wendepunkt der Denaturierungsisotherme wenn fF= FU = 0,5 und Kapp= 1 (F-8) Aus ihr lassen sich dann delta Gapp berechenen und in weiterer Folge delta Gaqu.
• Geben Sie eine empirische Beziehung zwischen der Stabilität der nativen Konformation eines Proteins und der Konzentration eines Denaturierungsmittels an. Es hat sich empirisch gezeigt dass für fast alle die Konformation beeinflussenden Effekte (Lösungsmittelzusätze, druck, Temperatur) das jeweilige delta G_app annähernd linear von der Konzentration X abhängt. Delta Gapp = delta Gaqu + m*X in einigen Messungen wie Fluoreszenz oder teils bei UV-Absorptionen muss mann einen linearen Korrekturterm (1+a*X) auf die rechte seite hinzufügen ( a kann größer oder kleiner null sein)
• Welche Möglichkeiten kennen Sie, um die Stabilität eines vorgegebenen Proteins zu er-höhen? Der native Zustand von Proteinen soll stabilisiert werden und gegen thermische bzw. chemische Denaturierung und inaktivierende Aggregation geschützt werden. 1.     Stabilisation erfolgt durch chemische Chaperone: Bindung spezifischer Liganden wirkt stabilisierend. Je stärker WW, desto effizienter wird native Form aus dem GW mit der entfalteten Form entzogen. (Nachteile: hohe Kosten, Inkompatibilität mit bestimmten Reinigungs- oder Modifikationsoperationen, Interferenz mit späteren Untersuchungen). 2.     Unspezifisch wirkende LM-Zusätze: meist KH, andere Polyole, AS, bestimmte Salze in relativ hoher Konzentration (1M), viele von ihnen sind „zelluläre Osmolyte“, da sie bei osmotischem Schock vermehrt gebildet werden, um Proteinaggregation zu verhindern, einige dieser Derivate begünstigen auch das reversible Ausfällen von Proteinen (Ammonsulfat, PEG) (F-4) Grund für Stabilisierung bzw die Verschiebung des GG nach links: Beruht darauf, dass alle Substanzen  eine "negative" Bindung an Proteinoberflächen zeigen. dh sie werden bevorzugt aus der Hydrathülle des Proteins ausgeschlossen. das ist thermodynamisch unvorteilhaft. eine entfaltung würde diesem Umstand nur noch steigern, daher minimieren LM-Zusätze die Grenzfläche Protein/LM
• Was sind die grundsätzlichen Konsequenzen aus dem Anfinsen-Experiment? Reversible Faltung an RNase A aus Rinderpankreas, 2 wesentliche Grundlagen zum Verständnis der in vivo Faltung Die 3D-Struktur von Proteinen ist offenbar eindeutig in der Primärstruktur angelegt. Heute weiß man: Entwicklung der natürlich vorkommenden Proteine stand offenbar unter einem starken Selektionsdruck hin zu Primärstrukturen welche eindeutig für wohldefinierte Raumstrukturen codieren. Die native (aktive) Konformation ist die thermodynamisch stabilste Form: der energetische Unterschied zw. Einer kompakt gefalteten Polypeptidkette und dem völlig entfalteten Zustand reflektiert eine delikate Balance zw. Stabilisierenden und destabilisierenden Effekten, wobei entropische Terme i.A. dominieren. (F-1)
• Zählen Sie wenigstens 4 verschiedene Methoden zur Verfolgung der De-/Renaturierung von Proteinen auf und beurteilen Sie jeweils kurz, inwiefern die Technik allgemein an-wendbar ist. 1.     Aktivitätsbestimmung: Kann man nur dann anwenden, wenn das Protein eine enzymatische Aktivität besitzt. 2.     UV/Vis-Absorption: Funktioniert dann, wenn die absorbtion vom Proteien im UV bzw im Sichtbaren Bereich liegt, und diese sich durch die De-/Renaturierung verändert. 3.     Innere Fluoreszenz: Funktioniert wenn die Proteiene Fluoreszieren, wenn man sie mit UV Strahlung bestrahlt. Meist durch den AS Phenylalanin, Tryptophan und Tyrosin 4.     NMR, FTIR, thermische Analyse, Analyse der Zugänglicheit von Wasserstoffatomen individueller Peptidbindungen (H1/H2 Austausch, detektiert mittels MS)
• Was muss man bei der Herstellung konzentrierter Lösungen von Harnstoff und Guani-dinium-Hydrochlorid beachten? Harnstoff und Guanidiniumchlorid zeigen beim Lösen in Wasser ausgeprägte Mischungseffekte (Abkühlen). Zur Herstellung der Lsg. Daher zunächst deutlich weniger Wasser (Puffer) als das gewünschte Endvolumen zugeben, und in der Wärme (Wasserbad) vollständig lösen, erst dann auffüllen.  
• Was muss man bei der Herstellung konzentrierter Lösungen von Harnstoff und Guani-dinium-Hydrochlorid beachten? Harnstoff und Guanidiniumchlorid zeigen beim Lösen in Wasser ausgeprägte Mischungseffekte (Abkühlen). Zur Herstellung der Lsg. Daher zunächst deutlich weniger Wasser (Puffer) als das gewünschte Endvolumen zugeben, und in der Wärme (Wasserbad) vollständig lösen, erst dann auffüllen.
• Warum arbeitet man bei der in-vitro Rückfaltung von Proteinen meist bei sehr hoher Verdünnung? Was kann man tun, um dies zu vermeiden? Hohe Verdünnung ist notwendig, um unspezifische Assoziationen hydrophober Regionen zwischen einzelnen Molekülen zu verhindern (was aber auch die Rückassoziation oligomerer Proteine behindert) Alternative Ansätze: 1.Fixieren des entfalteten Proteins an einer Matrix (kovalent, Ionenaustausch, via His-tag, etc.)2.Ausschlusschromatographie (Protein wandert dem Denat.mittel innerhalb der Säule langsam davon, Aggregation durch erschwerte Diffusion behindert)3.Faltung in einer Säule mit immobilisiertem Faltungskatalysator (Chaperon)4.Faltung in reversen Micellen (wässrige Innenphase in Vesikeln aus oberflächenaktiven Verbindungen, z.B. Phospholipide, Detergentien) in organischen LM)5.Zusatz kleiner/mittlerer Konz. Chaotroper Agentien (gleicher Grund)6.Bei rekombinanten Proteinen: Fusion mit kleinen, besonders leicht faltbaren Proteinen o. Anhängen eines Schwanzes mit strukturbegünstigenden Elementen
• Welche Aminosäuren können für besonders langsame Renaturierung verantwortlich sein? Prolin: im entfalteten Zustand liegen X-Pro-Peptidbindungen zu 20% in cis-Konfiguration vor. Normalerweise sind Peptidbindungen zu 99,9% in der trans-Konfiguration. Für die Faltung zur nativen Konformation ist bei X-Pro-Peptidbindungen also zum Teil eine Isomerisierung nötig (in vivo Hilfsenzyme, auch in vitro einsetzbar) Cystein: Kombination zweier Cystein-Seitenketten zu einer Cystin-Disulfidbindung ist unter oxidativen Bedingungen leicht durchführbar. Allerdings können sich Brücken zwiswchen falschen Cysteinen ausbilden. Diese müssen wieder getrennt und neu zusammengefügt werden. Disulfidbrückenbildung ist der Geschwindigkeitsbestimmende Schritt in der Renaturierung. ein Überschuss an niedermolekularen SH-Verbindungen (zB DTT oder GSH) machen Bindungen reversibel, und machen falsche Bindungen mit der Zeit unwahrscheinlicher --> trotzdem bleibt der Schritt geschwinsigkeitsbestimmend
• Zählen Sie 3 Vorgänge auf, die bei der Rückfaltung von reduziertem Lysozym die Aus-beute an katalytisch aktivem Lysozym reduzieren können. Unspezifische AggregatbildungFehlbildung der DisulfidbrückenZusätze, die die aggregationsgefährdeten Zwischnprodukte stabilisieren, können Proteine an ihrer Weiterfaltung behindern
• Wann gibt man bei in vitro-Faltungsversuchen niedermolekulare Thiolverbindungen zu und warum? Oxidationsmittel zur Wiederherstellung der Disulfidbindungen. Wenn Disulfidbrücken gebildet werden müssen. Sie machen Bindungen zwischen falschen Cysteinen reversibel und ersetzen so die in vivo vorhandenen Hilfsenzyme. Thiolverbindungen wirken als Katalysator für Renaturierung.
• Zählen Sie die wichtigsten Unterschiede zwischen einem typischen in vitro- Renaturie-rungs-Szenario und der in vivo-Faltung des gleichen Proteins auf. In vivo liegt eine einheitliche Population von naszierenden Polypeptiden vor, nicht eine Mischung verschiedenst entfalteter Moleküle.In vivo findet die Faltung bei hoher Proteinkonzentration statt, das ist in vitro aufgrund von Aggregatbildung kontraproduktiv. Eher arbeitet man in vitro bei hoher Verdünnung.In vivo sind Chaperone vorhanden und auch Teile des Ribosoms können Chaperonefunktion besitzen, in vitro kann man nicht alle Chaperone verwenden sondern manchmal nur Moleküle mit ähnlicher Wirkung (Bsp. Cyclodextrine) einsetzen. 
• Extrazelluläre (bzw. periplasmatische) Proteine besitzen zumeist intramolekulare Disulfidbindungen. Wie wird in vivo erreicht, dass sie sich überhaupt bilden und dass die richtigen Cystein-Paare miteinander verknüpft werden? Durch Hilfsenzyme wie zum Beispiel „Protein Disulfid Isomerase“ (PDI), im Lumen des ER, beschleunigt die Reaktion. Durch Zugabe eines Überschusses an niedermolekularen SH Verbindungen sind diese falschen Bindungen reversibel und werden mit fortschreitender Faltung immer unwahrscheinlicher. Aber die Bildung von Disulfidbrücken bleibt der Geschwindigkeitsbestimmende Schritt.
• Sie haben ein eukaryotisches Protein in E.coli exprimiert und haben es durch Solubili-sierung von inclusion bodies in 8M Harnstoff isoliert. Wie gehen Sie üblicherweise vor um das Protein zu renaturieren?   Protein langsam aus denaturierenden Bedingungen in solche überführen, die den nativen Zustand möglichst stabilisieren (pH, Ionenstärke, niedermolekulare Liganden…). Proteinkonzentration niedrig halten um unspezifische Assoziation zu verhindern. Berücksichtigen, wenn ein cysteinhaltiges Protein vorliegt, ausreichend Zeit für die Disuldifbrückenbildung lassen (und auch die Fehlverknüpfungen im Hinterkopf haben) mit Überschuss an niedermolekularen SH-Verbindungen nachhelfen (machen falsche Bindungen reversibel) langsame Rückfaltung begünstigen konterproduktive Konkurrenzreaktionen --> Ausweg wären hohe Verdünnungen oder ZUsätze, die aggregationsgefährtete Zwischenprodukte stabilisieren ABER. das kann auch eine Weiterfaltung behindern --> Gratwanderung hohe Proteinkonzentration möglich bei gebrauch von artificial chaperons, zB Cyclodextrine -> verfolgbar mit Aktivitätsmessung
• Beschreiben Sie ganz kurz das Konzept der Rückfaltung von Lysozym unter Einsatz von Cyclodextrin. Cyclodextrine sind ringförmige Makromoleküle, die aus mehreren α-(1→4)-glykosidisch verknüpften Glucoseeinheiten bestehen. Sie unterscheiden sich in ihrer Anzahl der Glukosebausteine. Die Strukturen von kleineren Cyclodextrinen gleichen einem hohlen Kegelstumpf mit polarer Oberfläche und lipophilem Innenraum. In diesem können Gastmoleküle inkludiert werden. C. binden relativ selektiv bestimmte Substanzen. Bei der Rückfaltung werden sie zur langsamen Entfernung des Detergens aus der Lösung eingesetzt. Deshalb bezeichnet man sie als „artificial chaperones“. Das Detergens sorgt dafür, dass das die entfalteten Proteine in Lösung gehalten werden können, es wird durch Cyclodextrin vom Protein abgestrichen, so dass dieses lokal mit der Rückfaltung beginnen kann, ohne dass die Gefahr einer vorzeitigen intermolekularen Assoziation bestünde.
• Was sind die wesentlichen Effekte die Sie sich vom Einsatz molekularer Chaperone bei der Rückfaltung eines denaturierten Proteins in vitro erwarten? schnellere Rückfaltungweniger Aggregationweniger Fehlfaltungen
• Warum ist Kaliumiodid ein wesentlich besserer Quencher der Trp-Floureszenz in BSA als z.B.: Acrylamid? Wegen seiner Ladung. Durch die elektrostatische Wechselwirkung in der überwiegend positiven geladenen Nachbarschaft von W134 liegt es dort angereichert vor. Dieser Effekt ist nicht zu beobachten bei ungeladenen (Acrylamid) oder kationischen Quenchern. So ist der Tryptophanrest in Proteine für den geladenen Quencher Iodid I- nur erreichbar, wenn der Tryptophanrest an der Oberfläche des Proteines in das wässrige Medium reicht. In Hydrophobe Bereiche kann Iodid nur schlecht vordringen. Für den Quencher Acrylamid ist der Tryptophanrest nur erreichbar, wenn sich der Tryptophanrest an der Oberfläche und in keiner zu kleinen Tasche befindet: Acrylamid kann auf Grund seiner Größe nicht in jede "Ecke" des Proteins vordringen.    
• Sie untersuchen ein globuläres Protein mit nur einem einzigen Trp-Rest, der praktisch keine Floureszenz zeigt. Worauf könnte das zurückzuführen sein? Trp-Rest ist gut für den Quencher zugänglich, die gesamte Anregungsenergie geht durch quenchen verloren, es kommt zu einem strahlungslosen Rückgang in den Grundzustand. Gute Zugänglichkeit zurückzuführen auf Exposition (umwelteinflüsse) der Trp auf Oberfläche des Proteins oder auf Entfaltung
• Auf welche Weise kann der durch Lichtabsorption zustande gekommene angeregte Zu-stand eines Moleküls diese zusätzliche Energie wieder verlieren? Relaxieren zum niedrigsten Schwingungsniveau vo von S1  und Rückkehr in Grundzustand unter Emission der entsprechenden Floureszenzquants Interkombination von S1 zum niedrigsten Triplettzustand (T1) (relativ langlebiger Zustand) und relaxieren untere Abgabe der entsprechenden Phosphoreszenz Quenchen: Kollision eines Fremdmoleküls (=Quencher) mit angeregtem Fluorophor unter portionsweiser Konsumation dessen Energie (strahlungsloser Verlust der Anregungsenergie)
• Was beschreibt die Stern-Volmer–Beziehung? Beschreibt die veränderte Intensität der Fluoreszenz in Gegenwart des Quenchers Die Stern-Volmer-Gleichung beschreibt die Abhängigkeit der Quantenausbeute bzw. der Intensität der Fluoreszenz eines fluoreszierenden Farbstoffes von der Konzentration von Stoffen, die die Fluoreszenz löschen (sogenannte Quencher). Mit der Stern-Volmer-Gleichung kann unter bestimmten Umständen auch die Abhängigkeit der Lebensdauer des angeregten Zustandes eines fluoreszierenden Farbstoffes von der Konzentration des Quenchers beschrieben werden
• Welche Information liefert mir die Stern-Volmer Konstante (Ksv)? k =       bimolekulare Quenchkonstante = eine Geschwindigkeitskonstante für die Bildung des XQ* Komplexes (=Fluorophor-Quencher-Komplex im angeregten Zustand) т =      die Lebensdauer des angeregten Zustandes   KSV ist ein Parameter für die Zugänglichkeit des Fluorophors für den Quencher, je größer KSV desto besser ist die Zugänglichkeit. Hohe KSV Werte erhält man, wenn das Fluorophor an der Oberfläche eines Proteins zu finden ist. In unserem Fall war das Fluorophor Trp.
• Was versteht man unter Kollisions-Quench? X (Flourophor) + h υ (Lichtenergie) ÞX*             (Anregung) Dh: Elektronen in einem der Orbitale des Moleküls können durch die Absorption von Lichtquanten geeigneter Wellenlänge in einen angeregten Zustand angehoben werden. Diese Zustände relaxieren innerhalb 1 ps zum niedrigsten Schwingungsniveau v0 von S1 (=“innere Umwandlung“) Dieser angeregte Zustand hat eine Lebensdauer von 0,5 bis 100 ns. Danach kehrt das Elektron unter Abgabe von einem bestimmten Fluoreszenzquant in den Grundzustand zurück.                         X* ÞX + h υ                          (Emission ohne Quencher) Während der Lebensdauer des angeregten Zustandes S1 (v0) können verschiedene Prozesse zum strahlungslosen Verlust der Anregungsenergie führen, was die Quantenausbeute der Fluoreszenz reduziert. Dazu gehört vor allem das dynamische Quenchen durch Fremdmoleküle ( = Quencher wie zB Iodid), die bei der Kollision mit dem angeregten Fluorophor dessen Energie portionsweise konsumieren = Kollisionsquench                         X* + Q Þ XQ*ÞXQ             (keine Emission in Gegenwart eines Quenchers)  
• Versuch zur Trp-Zugänglichkeit: Warum unterscheiden sich die Wellenlängen der jeweiligen Fluoreszenzmaxima bei den 3 untersuchten Substanzen? Die messbare Emission der meisten Proteine rührt ausschließlich von Trp her. Dieser Fluorophor ist eine ausgezeichnete natürliche Reportergruppe, da die Emission stark von der Polarität der unmittelbaren Umgebung des Indolrings abhängt (abnehmende Polarität führt zu einer Blauverschiebung im Emissionsspektrum). Diese Polaritätsabhängigkeit des Emissionspektrum führt bei den drei untersuchten Substanzen (OVA; BSA; freies Trp) zu einem Unterschied in der Wellenlänge der jeweiligen Fluoreszenzmaxima.
• Zum Unterschied von künstlich in Proteine eingeführte Fluorophore ist die Fluoreszenz von Tryptophanen relativ wenig intensiv. Wäre es bei den von Ihnen durchgeführten Messungen da-her besser gewesen, die Proteine bzw freies Trp in zB 5-fach höherer Konzentration einzuset-zen? Nein, wäre es nicht gewesen. Die Fluoreszenzintensität der Proteine bzw. des freien Tryptophans ist nämlich nicht von der Konzentration der Proteine bzw. von Trp abhängig. Stern – Volmer Gleichung: Io/I= 1 + k * т [Q] [Q]           Konzentration des Quenchers ist Io                Fluoreszenzintensität in Abwesenheit eines Quenchers I                   Fluoreszenzintensität in Gegenwart eines Quenchers k * т        siehe oben Daraus ist ersichtlich, dass die Konzentration der Proteine nicht mit der Fluoreszenzintesität zusammen hängt.
• Welche Aminosäureseitenketten (bzw funktionelle Gruppen) werden am häufigsten für kovalen-te Modifikationen herangezogen? Für eine kovalente Modifikation sind reaktive Seitenketten bevorzugte Ziele: Primäre Aminogruppen: Lysine und terminal Aminogruppen Grund der Modifikation: die mögliche Rolle in der biologischen Aufgabe des Proteins wird untersucht; die Solubilisierung des Proteins wird erleichtert; das Protein wird auf best. Aufgabe oder auf best. Bedingungen vorbereitet; freie Aminogruppen, welche in Folgereaktionen stören werden blockiert SH-Gruppen von Cysteinen: Grund der Modifikation:                                                                               meist für analystische Motive; daher ist der Erhalt der Funktion des Proteins meist nicht essentiell  
• Zählen Sie wenigstens 3 Gründe für die gezielte chemische Modifikation von Aminosäure-seitenketten in Proteinen auf. Obwohl schon sehr oft gezielte Mutagenese verwendet wird, hat auch die chemische Modifikation noch ihre Gründe bzw ihre Aufgaben: o    Untersuchung von Struktur- bzw. Funktionbeziehungen o    Hilfe zur Identifizierung der subzellulären Lokalisation o    Markierung eines Proteins (radioaktiv oder Fluoreszenz) o    Einführung von funktionellen Gruppen, welche in den natürlichen Aminosäuren nicht vorliegen o    Ermöglichung kovalenter Quervernetzungen (intra- bzw intermolekular)
• Welche Art der Modifikation (zu welchen Verbindungsklassen gehören die Reagentien und das jeweilige Produkt) von primären Aminogruppen in Proteinen kennen Sie? Bei welchem pH soll-te die Reaktion durchgeführt werden? Modiart, Reagenz,Produkt, Kommentar AcetylierungAcetanhydrid Þ AnhydridAmidNeutralisiert positive Ladung Quantifizierung freier Aminorgruppen2,4,6-Trinitrobenzolsulfonsäure Þ SulfonsäureAmin FluoreszenzmarkierungFluoresceinisothiocyanat (FITC) ÞIsothiocyanatAmin FluoreszenzmarkierungDansylchloridÞ SulfonylchloridSulfonylaminStablier als FITC, kleinere Quantenausbeute Cross-linkerDimethylsuberimidatdihydrochlorid Þ ImidatdihydrochloridImidathydrochlorid, unwahrscheinlich aber möglich ist AminHomobifunkt. Imidoester Cross-linkerDisuccinimidylsuberat Þ SuccinimidAmidHomobifunkt. Succinimidylester Bei einem pH von kleiner 8,5 sind Aminogruppen in typischen Proteinen protoniert und tragen daher eine positive Ladung. Das stabile Produkt der Reaktion mit SAA ist bei pH größer 5 nicht protoniert dh eine + Ladung wird durch diese Modifikation in eine – übergeführt. Die Reaktion verläuft bei einem pH Wert zwischen 7 und 9 optimal.
• Warum haben wir für die Untersuchung der Lysin-Modifikation ein saures Elektrophoresesys-tem gewählt? Durch die von uns durchgeführte Succinylierung von Aminogruppen „verschwindet“ eine positive Ladung, das Protein wird mit fortschreitender Modifikation relativ negativ geladen. Damit dieser Ladungsunterschied zur Auftrennung der unterschiedlich weitgehend modifizierten Proteinmoleküle führt, muss eine native Elektrophorese durchgeführt werden.  
• Warum führt man beim Experiment zur „Zählung" der Lysinreste eines kleinen Proteins keine SDS-Gelelktrophorese durch? Durch die von uns durchgeführte Succinylierung von Aminogruppen „verschwindet“ eine positive Ladung, das Protein wird mit fortschreitender Modifikation relativ negativ geladen. Damit dieser Ladungsunterschied zur Auftrennung der unterschiedlich weitgehend modifizierten Proteinmoleküle führt, muss eine native Elektrophorese durchgeführt werden.   SDS würde zu einer spezifischen Einheitsladung führen, und die Unterschiede übertönen. SDS = Sodiumdodecylsulfat ist ein Tensid. Mit seiner lipophilen Alkylgruppe bindet es an die Proteinoberfläche. Die Sulfatgruppe von SDS ist anionisch und hydrophil Þ je größer ein Protein desto mehr SDS bindet, desto negativer wird das Protein geladen.  
• Bei den meisten Proteinen können sämtliche vorhandenen Lysin-Seitenketten unter nicht-denaturierenden Bedingungen kovalent modifiziert werden. Warum? Die meisten Lysinseitenketten liegen auf oder nahe an der Oberfläche eines löslichen Proteins. Daher ist die Entfaltung meist keine Bedingung für die Modifikation. Es gibt allerdings durchaus interne Lysinreste, welche erst nach Denaturierung (Þ Protein wird entfalten) zum Beispiel mit Harnstoff oder ähnlichem zugänglich werden
• Gleichgewichtsdialyse ist die klassische Methode zur Untersuchung von Ligandenbindungs-Gleichgewichten. Zählen Sie einige Vor- und Nachteile der Methode auf. Das Bindungsprotein befindet sich in einem Dialysesack, der in eine Lösung mit bekannter Ligandenkonzentration gegeben wird. → Einstellung eines Gleichgewichts Innerhalb und außerhalb der Dialysemembran befindet sich nun dieselbe Konzentration an freiem Ligand L. Im Sack befindet sich der Ligand außerdem in Protein gebundener Form. Da die Gesamtmenge an Ligand bekannt ist, wird die Konzentration an freiem Ligand L in der äußeren Lösung ermittelt. Aus diesen beiden Werten lässt sich nun die Konzentration an gebundenen Liganden B bestimmen Vorteile: o    Die Konzentration an freiem Ligand L wird mit dieser Methode üblicherweise bestimmt o    Geringerer Anspruch an die Messgenauigkeit im Gegensatz zu alternativen Methoden wie zum Beispiel Ultrafiltration, Ultrazentrifugation oder Gelfiltration, etc. o    Fehleranfälligkeit ist geringer als bei den alternativen Methoden Nachteile: o    Ligand kann auch unspezifisch an die Dialysemembran und an die Gefäßwand adsorbiert seinÞ Durchführung einer analogen Serie ohne Protein o    Relativ großer Zeit- und MaterialaufwandZeitaufwand stellt bei begrenzter Stabilität einer oder mehrerer untersuchten Komponenten das größte Hindernis dar.  
• Warum nimmt die von Trp herrührende Fluoreszenz des BSA bei Bindung von ANS ab? Durch die Bindung von ANS an an den  Fettsäurebindungsstellen von BSA nimmt die Protein eigene Fluoreszenz ab. Somit wird BSA durch Bindung von ANS, welches bei 470 nm absorbiert gequencht. Der Quencheffekt vom Liganden an BSA ist die Ursache für die Abnahme in der Fluoreszenz des BSA. (->FRET)
• Sie untersuchen 3 verschiedene Protein-Liganden-Bindungsgleichgewichte unterschied-licher Affinität (mit einer KD von ungefähr 1M, 10µM bzw. 10nM) Welches dieser 3 Gleichgewichte wird experimentell am relativ einfachsten zu untersuchen sein? Vermutlich 10 µM 1M: relativ steiler Graph – sehr schnelle Sättigung- Messung verläuft in nur relativ kleinen Konzentrationsbereich, man muss hohe Konzentration sehr genau einstellen usw. generell hohe Genauigkeit erforderlich. 10nM: genaues Gegenteil, geringe Steigung, hohe Unempfindlichkeit
• Welche Parameter sollte man zum Beurteilen der möglichen biologischen Rolle eines Rezeptor(Protein-)Liganden Paares kennen? Kaff: Affinitätskonstante, ist der negative Anstieg des Scatchard Diagramms, Affinität vom Protein zum Ligand Bmax: Maximale Bindung, sollte der eingesetzten Proteinmenge entsprechen, jener Wert des Scatchard Diagramms wo die Gerade die X Achse schneidet. Es liegt hier eine Sättigung der Bindungsstellen vor.
• Die Darstellung von Bindungsdaten in Scatchard verleitet zum vorschnellen Legen einer Ausgleichsgerade. Was wird dabei häufig übersehen? Welche Kontrolle sollte man des-wegen machen?   Es wird häufig ein konkaver Kurvenverlauf übersehen (wenn zwei nicht identische Bindungsstellen vorliegen, oder negative Kapazität zwischen solchen wirksam ist). Als Kontrolle sollte man [B] gegen log [L] aufzeichnen und überprüfen ob ein asymptotischer Kurvenverlauf zu erkennen ist.
• Wie kann man Ligandenbindungs-Gleichgewichte untersuchen, wenn man Rezeptor und Ligand nicht voneinander trennen will (oder kann, wie zB bei Protein-Protein-Wechselwirkungen) Im Allgemeinen werden spektroskopische Methoden herangezogen. Ein Partner wird in steigender Konzentration zu vorgegebener Menge des zu bestimmenden Partners zugegeben und man die Veränderung des Messwertes durch die immer weiter voranschreitende Ausbildung des Protein-Liganden-Komplex registriert. Durch Extrapolation dieser Messdaten gegen unendliche Konzentration des variierten Partners(doppelt reziprok) erhält man den veränderten Messwert für den  Sättigungsfall. Damit lässt sich für jede Mischung die Lage des Gleichgewichtes berechnen (Scatchard).
• Wir haben die Bindung von ANS an BSA ohne Protein-gebundenes von nicht gebunde-nem ANS zu trennen. Alternativ hätten wir zB mit radioaktiv markiertem Bilirubin und Trennung der beiden Phasen arbeiten können. Welche Vor- und Nachteile hätte dies ge-habt? Vorteil: Hohe Empfindlichkeit durch Radioaktivität geeignet für kleine Kaff Nachteile: Radioaktivität (Sondermittel, teuer)Es ist Trennung notwendig, da man sonst nicht von gebundenen-ungebundene unterscheiden kann!Großer Material- und Zeitaufwand, letzterer bei begrenzter Stabilität der Analyte problematischAlternativen: Ultrazentrifunge, Gelfiltration etc.. hohe FehleranfälligkeitGleichgewichts-Dialyse: man muss unspezifische Adsorption berücksichtigen 
• Nach dem Aufbrechen des biologischen Materials folgt bei den meisten Proteinisolie-rungen die sogenannte „capture phase“ (also das möglichst quantitative Herausholen des gesuchten Proteins aus dem Rohhomogenat). Welche Methoden wären dafür geeig-net? a) mechanisch: Elektr. Mixer, Ultra-Turrax, Homogenisierung nach Potter-Elvehjem bzw. Dounce, Schütteln mit Glaskugeln, Ultraschall, Zermahlen von Zellen mit flüssigem Stickstoff, Merkenschlager Homogenisator b) chemisch: organische Lösungsmittel, enzymatische Zerstörung
• Für welche Proteine wird Ionenaustauschchromatographie mit besonders hoher Anrei-cherung einhergehen?   Ionenaustauschchromatographie beruht auf der kompetitiven WW geladener Ionen. 1)    Analyt bindet an geladene Positionen an stationärer Phase 2)    Verdrängung des Analyten durch steigende Salzkonzentration (sättigt Ladungen besser und schonender ab als pH-Gradient) ausgezeichnete Trennleistung, wenn die Stoffe pH-abhängige Unterschiede des Ladungszustands aufweisen und ihre Löslichkeit nicht sehr verschieden ist.  
• Zählen sie einige Wechselwirkungen auf, die man sich dabei der Affinitätschromatogra-phie zu Nutze machen kann.   Enzym – Substrat, Coenzym, Inhibitor, Effektor Antigen – Antikörper Hormonrezeptor – Hormon, Hormonderivat Repressorprotein – Corepressor, Derepressor Vitaminbindendes Protein – Vitamin, Vitaminderivat  
• Bei sehr verdünnten Proteinlösungen kommt es auch bei Ammonsulfatsättigung zu kei-ner Fällung. Wie könnte man solche Lösungen sonst konzentrieren? Ultrafiltration unter Druck umgekehrte Dialyse (Sack mit wasserbindenden Substanzen wie Zellstoff, PEG außen die Wasser entziehen) Austauschergele
• Affinitätschromatographie ist teuer, aber sehr effizient. Was muss man bei der prakti-schen Durchführung beachten? Beim Befüllen der Säule: Um ideale und gleichmäßige Flussgeschwindigkeiten zu erreichen peristaltische Pumpe verwenden.Gel nicht trocken laufen lassenKeine Luftbläschen, daher Schräg halten beim Befüllen und Suspension entgasen, keine kalten Puffer verwenden; Vor dem Füllen der Säule etwa 15 min auf einer Temperatur halten.Äquilibrieren vor dem BefüllenNur völlig klare Lösungen auf Säule auftragen, vorher ev. zentrifugierenpH Wert des Puffers muss stimmen, nicht zu sauer oder zu alkalisch – Denaturieren des Proteins 
• Gelfiltration führt normalerweise nicht zu sehr großen Anreicherungen. Sie wird aber trotzdem regelmäßig eingesetzt. Was sind ihre Vorzüge? = Größenausschluß, Moleküle werden der Größe nach = der Permeation nach aufgetrennt, bei porösen Trägermolekülen dringen kleinere Moleküle in die Poren ein und brauchen länger zum Durchlaufen. Anwendungsgebiete: Trennung nach Größe, Reinigen von Salzen in Lösungsmittel, Molekulargewichtsbestimmung ZB ich habe ein Protein in Phosphatpuffer vorliegend. Beim folgenden Vorhaben würde Phosphat stören und kann mit Gelfiltration entfernt werden. schnell & billig?
• Zum Nachweis zahlreicher Enzyme werden gekoppelte Tests mit einem oder (selten) zwei „Hilfsenzymen“ verwendet. Worauf muss man beim Etablieren eines derartigen Tests achten? Gekoppelter Enzymtest ist: Produkt des ersten Enzyms ist das Substrat des zweiten Enzyms. Über die Aktivität, bzw das Produkt des zweiten Enzyms kann die Aktivität des ersten bestimmt werden (Reporterreaktion). Beispiel: PK-Produkt als Substrat für LDH. Im Überschuss müssen alle Substrate und Kofaktoren und das zweite Enzym zugegeben werden, Limitierend muss das erste Enzym sein. –       wenn die Aktivität des Hilfsenzyms zu niedrig ist, gibt es zuwenig Substrat für das nachzuweisende Enzym, das dadurch kaputter aussieht, als es ist –       beide Enzyme müssen unter den gegebenen Bedingungen (Temperatur und Chemie der Lösung…) funktionsfähig sein
• Wie ändern sich im Verlauf einer Enzymisolierung über mehrere Reinigungsschritte: a) die Gesamtaktivität des betreffenden Enzyms? b) der Proteingehalt der jeweiligen Enzymextrakte? c) die spezifische Aktivität (Definition! Aktivität pro Masseneinheit) des betreffen-den Enzyms? a) steigt vielleicht leicht, wenn Inhibitoren entfernt werden; bleibt ansonsten gleich b) die gesamtProteinmenge sinkt. c) sp. Akt. = Akt. im Verhältnis zur Gesamtproteinmenge steigt stark Diagramm: spezifische aktivität über Zeit linearer Anstieg (nicht vom 0 Punkt starten)  
• Sie haben ein Protein laut SDS-PAGE homogen gereinigt. Trotzdem ist die spezifische Aktivität geringer als im vorangegangenen Reinigungsschritt. Was könnte passiert sein? Sds -> unfolded proteins -> nicht 100% kann korrekt refolden -> nur ein bruchteil folded korrekt -> weniger aktivität/gramm protein da der anteil unfolded/missfolded grösser wurde

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