Bedeutung der PCR
PCR = Polymerase Chain Reaction, Polymerasekettenreaktion dient zur Vervielfältigung genetischen Erbguts wie z.B.: der DNA
Ablauf einer PCR
Denataurierung→ 90°– 95°C→ Wasserstoffbrückenbindungen lösen sich→ DNA liegt in Einzelsträngen vor→ Dauer: wenige Minuten Hybridisierung→ 50°– 60°C→ als Primer fungierende komplementäre Oligonucleotide (15 – 30 Nucleotide) binden an die einzelsträngige DNA Polymerasisation→ 70° – 75°C (Optimum der modifizierten Taq-Polymerase)→ Taq-Polymerase synthetisiert die DNA komplementär→ Dauer: Verdopplung innerhalb von weniger als 10 Minuten→ 20 – 30 Zyklen
Bestandteile einer PCR
Primer DNA (isoliert | doppelsträngig) DNA-Polymerasen Thermocycloer Nucleotide
Alle Gene eines Organismus (gesamte DNA)
Genom
Alle Proteine die vom Genom eines Organismus hergestellt werden können.
Proteom
Summe aller Transkripte die vom Genom eines Organismus hergestellt werden können
Transkriptom
Mutationsformen
Genmutation (→ Veränderung der Basensequenz innerhalb eines Gens) Chromosomenmutation (→ Veränderungen in der Struktur von Chromosomen | größere Chromosomenabschnitte sind betroffen) Genommutationen (→ nummerische Veränderungen der Chrosomenanzahl oder des gesamten Chromosomensatzes)
Arten der Genommutation (nummerische Veränderungen der Chromosomenanzahl oder des Chromosomensatzes)
Aneuploidie (→ Zahl einzelner Chromosomen ist erhöht oder vermindert) Euploidie (→ verminderter oder erhöhter Chromosomensatz)
Arten der Genmutation (Veränderung der Basensequenz innerhalb eines Gens)
Punktmutation (→ Austausch einer Base) Leserastermuation
Punktmutation (Austausch einer Base)
Stumme Mutation (→ andere Base, aber selbe Aminosäure) Missense – Mutation (→ andere Base, andere Aminosäure) Nonsense – Mutation (→ andere Base die zu einem Stoppcodon führt)
Arten der Leserastermutation
Deletion einer Base Insertion einer Base Deletion eines Tripletts
Arten der Chromosomenmutation (Veränderung in der Struktur von Chromosomen | größere Chromosomenabschnitte sind betroffen)
Deletion (→ Chromosomenstück geht verloren) Duplikation (→ Verdopplung eines Chromosomenstückes) Inversion (→ Chromosomenstück wird verkehrt herum in das Chromosom eingebaut) Rezipoke Translokation (→ Austausch von Chromosomenstücken zwischen zwei nicht homologen Chromosomen)
DNA-Reparatur
Reversion durch: Exzisionsreperatur (veränderte Nucleotide werden von Exonucleasen herausgeschnitten) Fehlpaarungsreparatursystem Rekombinationsreparatur (Behebung von Doppelstrangbrüchen)
Arten der Genregulation
Endproduktrepression Substrahtinduktion eukryotische Genregulation bei der Proteinbiosynthese
Endproduktrepression
negative Genregulation Bestandteile: Regulatorgen, Promotor, Operator, Strukturgene, (⇒ Gesamt: trp – Operon), Repressor Repressor anfangs inaktiv Produkt der Strukturgene aktiviert Represser, welches das Operon hemmt und die Synthese stoppt http://www.guidobauersachs.de/bc/trp2.jpg
Substrahtinduktion
positive Genregulation Bestandteile: Regulatorgen, Promotor, Operator, Strukturgene, (⇒ Gesamt: trp – Operon), Repressor Repressor anfangs aktiv Produkt der Strukturgene verbindet Edukt, welches in das aktive Zentrum des Repressors geht und diesen inaktiviert https://www.researchgate.net/profile/Vijay_Kumar91/publication/292262701/figure/fig4/AS:323489350340611@1454137279218/Figure-4-Lac-operon-and-its-regulation-The-lac-operon-comprises-of-three-genes-that.png
Inaktives Chromatin
Heterochromatin eng um die Histone gewickelt Stilllegung durch Kondensierung Stilllegung durch Methylisierung (-CH3)→ an die Base Cytosin→ an die aus den Nucleosomen herausragenden Histonschwänze⇒ Folge: Transkriptionsrate sinkt
Aktives Chromatin
Euchromatin locker um die Histone gewickelt Auflockerung durch Anlagerung von Acetylgruppen (-COCH3)⇒ Folge: Transkriptionsrate steigt
Genregulation bei den Eukaryoten
Chromatin – Umstrukturierung→ Kondensierung des Chromatins von Euchromatin in Heterochromatin durch Methylisierung (-CH3) ⇒ Transkriptionsrate sinkt→ Kondensierung des Chromatins von Heterochromatin zu Euchromatin durch Acetylisierung (-COCH3) ⇒ Transkriptionsrate steigt Transkription→ Promotor (TATA-Box)→ Transkriptionsfaktoren (Proteine) binden an regulatorische DNA-Abschnitte→ weitere regulatorische Proteine die in größerer Entfernung an die DNA gebunden werden – Enhancer (Verstärker) – Silencer (Dämpfer)→ durch Schleifenbildung RNA – Prozessierung→ alternatives Spleißen→ RNA-Editing (Einfügen von Basen in die mRNA) Abbau der mRNA→ unterschiedlich lange Existenzzeiten→ enzymatischer Abbau von CAP und Poly A→ Abbau des gesamten Nucleosoms→ micro RNA (mi-RNA), si-RNA, RISC | RITS ⇒ eukaryotische, nicht für den Proteinbau codierte, RNA-Moleküle (20-25 Nucleotide) Translation→ mehrere Ribosome übersetzen gleichzeitig eine mRNA Posttranslationale Modifikation→ Aktivierung | Inaktivierung von Proteinen durch: – Phosphatgruppen – Zuckerketten – eingefügte Aminosäuren Proteinabbau→ wenn nicht mehr benötigt, Abbau durch Enzymkomplex (Proteasom)
Was ist Epigenetik?
Bei gleichem Genotypen führen verschiedene Methylisierungsmuster zu verschiedenen Phänotypen (reversibel). Dies kann ebenfalls durch die Modifikation von Histonen geschehen und mitotisch in die nächste Zell-, sowie durch Keimzellen in die nächste Individuengeneration vererbt werden.
Methylisierung der DNA
an die Base Cytosin an die aus den Nucleosomen herausragenden Histonschwänze→ Raumstruktur der DNA wird verändert→ RNA-Polymerase wird blockiert→ Transkription wird verhindert ⇒ betroffene Gene sind ausgeschaltet
Histonkomplex in der DNA
acht Histone Nukleosom
Modifikation der Histone
Heterochromatin (eng um das Nukleosom gewickelt)⇒ DNA ist nicht lesbar | keine Transkription (durch z.B.: Histon-Deacetylase) Euchromatin (locker um das Nukleosom gewickelt)⇒ DNA ist lesbar | Transkription (durch z.B.: Acetylgruppen, Histonactyl-Transferase)
Auftrennungs- und Nachweisverfahren in der Gentechnik
Gelelekrophorese
Gelelektrophorese
wässrige Pufferlösung Gel (Molekularsieb) Taschen Glasplatten kürzere Fragmente wandern schneller zur Anode spezifisches Bandenmuster Fluoreszensmittel und eine Nylonmembran zur Übertragung Vaterschaftstest meist durch Restriktionsendonucleasen | Restriktionsenzyme (→ blunt | sticky ends, glatte | klebrige Enden)
DNA-Sequenzierung
nach Sanger Kettenabbruchmethode Fluoreszenzfarbstoff wird verwendet wird in vitro synthetisiert Gelelektrophorese Shotgun Platte mit Vertiefung → Lichtblitz
Sequenzvariation in der DNA die eindeutig identifizierbar sind
genetischer Marker
Unterschiede in der Nukleotidsequenz (⇒ Sequenzunterschiede)
Polymorphismen
Minisatelliten (VNTR variable number tandem repeats)
Nukleotidsequenz mit bis zu 100 Kopien 20-40 Basenpaare Anzahl und Anordnung ist hoch variabel nur Introns
RFLPs (Restriktionsfragment Längenpolymorphismus)
Mutationen in den Introns Kausal für die Bandenmuster der Gelelektrophorese bedingt durch die dadurch entstehenden Schnittstellen
Mikrosatelliten (STR short tandem repeats)
10-15 Kopien 2-4 Nukleotide nur Introns, da diese durch selektionsneutrale Mutationen erheblich variieren Gelelektrophorese
Southern Blotting
PCR Gelelektrophorese Sonden Fluoreszenz Peaks
Schritte der Klonierung
Isolierung aus DNA, jedoch: Exons und Introns reife mRNA künstlich mit Aminosäuresequenzen Schneiden Restriktionsendonukleasen Ligasen Übertragung in einen Vektor Transformation (Einschleusung) Viren und Bakterien (Plasmide) Selektion und Transformation kein Plasmid, Plasmid ohne DNA, Plasmid mit DNA⇒ http://www.spektrum.de/lexika/images/biok/f2f615.jpg
Kultivierungsmethoden
Flüssigkeitskultur→ Vorteil: schnelle Vermehrung Plattenkultur (häufig Agarplatten)→ Vorteil: Bildung von Kolonien aufgrund nicht möglicher Fortbewegung Herstellung von Reinkulturen Untersuchung kleinerer Mengen
Verdünnungsreihe
Auffüllung eines Mililiters der Ausgangskultur mit steriler Kulturflüssigkeit auf 10 Mililiter
Aufbau eines Bakteriums
ringförmige DNA äußere Zellmembran Zellwand innere Zellmembran Nukleotid Plasmid Ribosom Zellplasma Porine Geißel http://www.u-helmich.de/bio/cytologie/01/bilder/Bakterienzelle.jpg
mRNA
messanger RNA Matrize (Kopie der DNA zur Proteinbiosynthese) Nukleotide
tRNA
transfer RNA Kleeblattstruktur transportiert Aminosäuren zum Ort der Proteinbiosynthese
Stoppsequenz
Terminator
Transkription
Initiation→ RNA-Polymerase bindet an Promotor des codogenen Stranges Elongation→ DNA-Doppelstrang wird auf einer Strecke von 15-20 Basenpaaren entwunden→ codogener Strang (3'-5') wird komplementär synthetisiert zu einem RNA-Strang (Ersetzung der Base Thymin mit Urazil)→ Doppelstrang schließt sich wieder Termination→ RNA-Polymerase trifft auf Stoppsequenz (Terminator)→ Beendung der Transkription und Lösung von der DNA
rRNA
ribosomale RNA globulär (kugelförmiges Protein) bildet mit Proteinen die Ribosomen Ort der Translation 4 Arten (120, 150, 1700, 3500 Nukleotide) EPA-Stellen bei der Translation
Erste Aminosäure bei der Translation
Methionin
Translation
tRNA mit Startcodon (Methionin oben, unten das passende Basentriplett AUG) setzt sich an der mRNA ab → kleine ribosomale Untereinheit bildet sich große ribosomale Untereinheit bildet sich, Methionin befindet sich auf der P-Stelle rRNA wandert, Methionin wird an die Aminosäure der tRNA, welche sich an der A-Stelle befindet weitergeben, die tRNA der P-Stelle wandert zur E-Stelle, die der A-Stelle zur P-Stelle und eine neue tRNA setzt sich an der A-Stelle ab Weiterführung bis zum Stoppcodon, Abbau der rRNA⇒ neues Protein ist entstanden
Proteinbiosynthese bei den Prokaryoten
Transkription und Translation können gleichzeitig stattfinden mRNA wird mehrfach abgelesen (von mehreren Ribosomen) kein Zellkern → Translation kann beginnen bevor Transkription abgeschlossen ist
Proteinbiosynthese bei den Eukaryoten
neben der Transkription und Translation gibt es zudem die Prozessierung prä-mRNA Introns, Promotor und Terminator werden durchs Spleißen herausgeschnitten Kappe und Poly-A-Schwanz zur Verhinderung des Verschleißes beim Transport aus dem Zellkern alternatives Spleißen
Prozessierung
posttranskriptionale Modifikation eukaryotischer RNA prä-mRNA → reife RNA Capping (Schutz vor enzymatischem Abbau beim Transport aus dem Zellkern) Polyadenylierung (Schutz vor enzymatischem Abbau bei Transport aus dem Zellkern) RNA-Editing (→ Verändern einzelner oder mehrere Nukleinbasen) Splicing | Spleißen (Introns, Terminator und Promotor werden herausgeschnitten) Alternatives Spleißen (nur bestimmte Exons werden benötigt)
DNA-Replikation
Initiationsphase: Verhinderung von Entspannungsreaktionen durch die Topoisomerase Entspiralisierung der Doppelhelix und Trennung des Doppelstanges enzymatisch durch Helikase Synthese eines kurzen komplementären RNA-Stranges (Primer) als Startmolekül für die DNA-Polymerase 3 durch die Primase Elongationsphase Kontinuierliche 5'-3'-Verknüpfung (DNA-Strang ist 3'-5') von DNA-Nukleotiden zu einem komplementären Strang (Leitstrang) durch die DNA-Polymerase 3 Diskontinuierliche Verknüpfung des Folgestranges (3'-5' | DNA: 5'-3') durch die DNA-Polymerase 3 Synthese in Richtung der sich öffnenden Replikationsgabel Okazaki-Fragmente entstehen am Folgestrang Entfernung der DNA-Primer und Ersatz der fehlenden DNA-Nukleotide durch die DNA-Polymerase 1 Verknüpfung der Okazaki-Fragmente durch die Ligase Terminationsphase⇒ Model ist semikonservativhttps://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/6/69/DNA_replication_de.svg/691px-DNA_replication_de.svg.png
