Mikrobiologie (Fach) / Das mikrobiologische Labor (Lektion)

Diese Lektion wurde von maria0601 erstellt.

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• Woraus besteht ein typisches Nährmedium? Hauptanteil meist Wasser eine für den  jeweiligen Organismus verwertbare Energiequelle (zB. organische oder schwefelhaltige Verbindunge) vom Organismus benötigte Nährstoffe (C-, N-, S- od. P-Quelle) evtl. Farbstoffe, Geliermittel (AgarAgar), Hemmstoffe (Antibiotika), Indikatoren, Pufferstubstanzen (um pH-Wert zu stabilisieren), Wachstumsfaktoren (Vitamine, Hormone, etc.)
• Wie können Nährmedien eingeteilt werden? Nach Zusammensetzung: synthetische Nährmedien: definierte chemische Zusammensetzung komplexe Nährmedien: mehr od. weniger exakt definierte Bestandteile- Pepton: Eiweißspaltprodukte; hergestellt durch enzymatische Verdauung tierischer und pflanzlicher Proteine- Fleischextrakt: wässriger Extrakt von enzymatisch vorverdautem Fleisch- Caseinhydrolysat: salzsaures Hydrolysat aus Milcheiweiß ohne niedermolekulare Spaltprodukte; liefert freie AS- Malzextrakt: wässriger Extrakt von Malz; spez. Bestandteil von Pilz-Nährmedien- Hefeextrakt: wässriger Extrakt aus autolysierter Hefe; liefert viel C- und N-Verbindungen → Lieferanten für C, N, AS, Vitamine, Mineralstoffe, Spurenelemente!! Nach physikalischen Eigenschaften: fest (Agar) weich (Weichagar) flüssig (Bouillon) Nach Verwendungszweck: Universal/Kollektivmedium Selektiv/Elektivmedium Differentialmedium (Indikatornährboden) Anreicherungsmedium (selektiv/nicht selektiv) Mangelmedium/Sporulationsmedium Aufbewahrungs-, Transport-, Tiefgefriermedium...
• Ablauf der Nährmedienherstellung Nährbodenkonzentrat einwiegen Suspendieren in destilliertem Wasser Zugabe von Verfestigungsmitteln (bei festen/halbfesten Medien) Nährsubstrat auflösen/aufschmelzen (Dampf, heizbarer Magnetrührer, Mikrowelle) pH-Kontrolle / -Korrektur Sterilisation: Inaktivieren aller Lebewesen inkl. ihrer Ruhestadien (Sporen)
• Wie können Nährmedien sterilisiert werden? Hitzesterilisation Denaturierungseffekt abgetötete MO verbleiben im Sterilisiergut - Autoklavierug: Sattdampfatmosphäre; 121°C / 1 bar / 20 min.     -> je größer die Volumina, desto länger die Autoklavierungsdauer!! - Tyndallisation (diskontinuierliche/fraktionierte Sterilisation):     100°C / 30 min.     30°C / 12-24 Std. (Zwischenbebrütung, Sporenkeimung)     100°C / 30 min.     evtl. weitere Wiederholungen   Sterilfiltration - "mechanische Sterilisation" Mikrofilter mit definierter Porenweite: 0,22 µm / 0,45 µm Celluloseacetat, Cellulosenitrat ggf. Vorfiltration vor eigentlicher Sterilfiltration  
• Sterilfiltration = mechanische Filtration Filter mit definierter Porenweite: 0,22 µm / 0,45 µm Celluloseacetat, Cellulosenitrat ggf. Vorfiltration vor eigentlicher Sterilfiltration
• Hitzesterilisation Denaturalisierungseffekt abgetötete MO verbleiben im Sterilisiergut - Autoklavierung (Überdruck) Sattdampfatmosphäre 121°C / 20 min. / 1 bar Achtung: je mehr Volumen, desto länger dauer die Autoklavierung - Tyndallisation (diskontinuierliche/fraktionierte Sterilisation) 100°C / 30 min. 30°C / 12-24 Std. (Zwischenbebrütung, Sporenkeimung) 100°C / 30 min. evtl. Wiederholungen
• trockene Hitze Hitzesterilisation von trockenen Glasgeräten (Pipetten, Kolben, Röhrchen, Petrischalen etc.) Heißluftsterilisator, gute Luftzirkulation, Sterilisiergut nicht zu eng packen Check mittels Indikatorbändern oder Bioindikatoren Vorsicht bei Gummi- und Kunststoffstopfen!! 160°C/180 min. - 170°C/120 min. - 180°C/30 min.   Abflammen (Impfbesteck)
• Strahlung UV-Strahlung Nucleinsäureschädigung Raumluft, Oberflächen, Trinkwasser geringe Eindringtiefe UV-C-Bereich am wirksamsten (200-280 nm) Quecksilber-Niederdruckstrahler (253,7 nm) Ozon -> in unbenutzten Räumen Isolierende Strahlung Sterilisation von Einwegmaterialien, Gewebsersatz und Antibiotika Gamma-Strahlen produzieren freie Elektronen, Radikale Schädigung der DNA Bestrahlungsdosis in Gray (Gy)
• Verhaltensregeln im Umgang mit Mikroorganismen Alle Gegenstände sind so zu behandeln, als ob sie pathogenes Material enthielten Tragen von Schutzkleidung Schmuckverbot Essen, Trinken, Rauchen im Labor verboten Beschriften von Behältnissen Kontaminierte Gegenstände dekontaminieren Achtung auf Luftkontamination / Aerosolbildung Schutz von Personal und Umwelt Genehmigung der Behörde für Arbeiten mit human- und tierpathogenen Erregern! Einstufung der "biologischen Arbeitsstoffe" in Risikoklassen (1-4)
• Einteilung der MO bezüglich Risikopotenzial (1) kein oder geringes Risiko für Mensch und Wirbeltiere, als Krankheitserreger für Gesunde keine Bedeutung Acetobacter, die meisten Lactobazillen, teilweise E.coli, Saccharomyces,... (2) geringes bis mäßiges Risiko für Mensch und Wirbetiere, potentielle Krankheitserreger beim Menschen, wirksame Vorbeugung und Behandlung normalerweise möglich pathogene E.coli, Clostridium tetani,... (3) mäßiges bis hohes Risiko für Mensch und Wirbeltiere, Erreger schwerer Erkrankungen, wirksame Vorbeugung oderBehandlung normalerweise möglich Chlamydia psittaci, Salmonella typhi, Yersinia pestis, Francisella tularensis (4) hohes Risiko für Mensch und Wirbeltiere bestimmte Viren: Ebola, Marburg,....
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• Umgang mit MO der Risikostufe 2 Arbeitsraum mit Label kennzeichnen Sicherheitsschleuse mit Dekontaminationsmöglichkeit tägliche Desinfektion der Flächen Schutzkleidung nie außerhalb tragen Verwendung von starken Latexhandschuhen Arbeiten in Sicherheitswerkbänken Bunsenbrenner mit Spritzschutzglocke Verwenden von Einwegartikeln Kontaminierte Geräte in Desinfektionsbad einlegen Sofern Kontamination eintritt Bereich sperren und desinfizieren Abfallsammlung und -entsorgung (Dekontamination)
• Grundausrüstung für ein mikrobiologisches Labor Bunsenbrenner Wasserbäder Inkubationsschränke Photometer Autoklav Heißluftsterilisator Dampfschrank Markierungsstift Schüttelinkubator Anaerobiertopf Petrischalen Pipetten Pipetierhilfe Röhrchen / Eprouvetten Eprouvettenverschlüsse Impfösen Impfnadeln Drigalskispateln Skalpell / Schere / Stanleymeser Einwegartikeln (Impfbesteck,....)
• Welche mikroskopischen Präparate haben Bedeutung in der Mikrobiologie? Lebendpräparate Deckelglaspräparat hängender Tropfen Zählkammerpräparat Färbepräparate Indirekte Färbung (z.B. Tuschefärbung) Direkte Färbung (Gramfärbung, Endosporenfärbung, Kapselfärbung, Geißelfärbung, Säurefestigkeitsfärbung) Feuchtkammerpräparate Darstellung von Schimmelpilzen
• Anreichern von MO - Vorgang und Zweck Erhöhung der Keimzahl bzw. Zellmasse Zweck: Nachweis - Identifizierung - Gewinnung von Zellmasse (1) Kollektives Anreichern: möglichst viele / alle MO zum Wachsen bringen (2) Selektives Anreichern: nur bestimmte MO zum Wachsen bringen Selektive Agenzien: pH-Wert Hemmstoffe (zB. Antibiotika) Verhalten gegenüber Sauerstoff Indikatoren im Nährsubstrat
• Kollektives Anreichern möglichst viele / alle MO zum Wachsen bringen optimale Bedingungen in einem Kollektivmedium
• Selektives Anreichern Nur bestimmte MO zum Wachsen bingen Selektivmedien -> spezifisch optimierte Wachstumsbedingungen Selektive Agenzien: pH-Wert Verhalten gegenüber Sauerstoff Antibiotika, andere Hemmstoffe Indikatoren im Nährsubstrat
• Welche morphologischen Merkmale können Sie bei der AEROBEN Kultivierung von MO beschreiben? in Bouillon: Bodensatz Trübung Flockenbildung Hautbildung Ringbildung auf festen Nährböden: knopfförmig halbkugelig konvex erhaben flach wellig, rundlich glatt, rundlich unregelmäßig gezahnt filamentös wurzelförmig
• Wie können MO ANAEROB kultiviert werden? Absenkung des Redoxpotentials: reduzierende Substanzen (zB. Cysteinhydrochlorid) Verbrauch des Sauerstoffs im Inkubationsmilieu durch spezielle Hilfsmittel: Katalysatoren, Verdrängen mit Gas,... chemische Reaktionen
• Was bedeutet REINZUCHT von MOs? (Ablauf, Beispiele, Zweck) Maßnahmen, die zu einer Kultur führen, die nur aus einer Art bzw. einem Stamm besteht! Ablauf: Probe mit Mischflora -> Anreicherung -> Fraktionierter Ausstrick -> Reinkultur Ziel: Einzelne Kolonien auf Nährsubstrat, gleiches Aussehen, gleiche Größe => gleiche Eigenschaften Beispiele: Micrococcus luteus Serration marcescens
• Wie ist die Reinkultur definiert? Eine Reinkultur besteht zu 100% aus einer Art bzw. einem Stamm.
• Welche Möglichkeiten gibt es zur Erreichung einer Reinkultur bei Vorliegen einer Mischkultur? Verdünnungsausstrich: sorgfältiges Abtrennen und wiederholtes Ausstreichen
• Beschreiben Sie an einem selbstgewählten Beispiel die Reinkultivierung von Bakterien Bsp: Bazillen von einem Gegenstand Abklatschen in Agar Bebrüten nach einer gewissen Zeit mit Impföse Bakterien entnehmen auf Agarplatte aufstreichen (fraktionierter Ausstrich!) Bebrüten Erhalt der Reinkultur
• Mit welcher Strategie werden MO identifiziert? Stufenweise Analyse: (1) Keimzahlbestimmung, selektiver Keimnachweis, allg. Qualitätsmerkmale, morphologische Charakteristika, Indikatorkeime (2) Spezieller Keimnachweis, physiologische Charakteristika, serologische Bestätigung (3) Identitätsprüfung auf molekularbiologischem Niveau, DNA-Hybridsondentechnik, PCR (4) Aufklärung der genetischen Struktur, Gefahrenpotential, Sicherheit
• Wichtige phänotypische (Schnell-)Tests in der Mikrobiologie Tests mit Röhrchen (manuell) Miniaturisierte Testkits (API, BIOLOG, OXI-FERM etc) Farbveränderungen (KH-Verwertung) Enzymatische Aktivitäten "Schnelltests" (Automatisierung, PC-Datenbank-Auswertung,...) Ergänzende Tests: Oxidase-Test, Katalase-Test, Nitratreduktion, Koagulase-Tests, ...
• Mit welchen Methoden kann die Keimzahl von Bakterien/Hefen bestimmt werden? Direkte Methoden: Zählkammer Mikroskopischer Ausstrich Elektronische Verfahren Mikroskopische Verfahren kombiniert mit Membranfiltertechnik Indirekte Methoden: Trübungsmessung Erfassung mikrobieller Stoffwechselprodukte Kulturelle Methoden: Koch'sches Plattenverfahren Membranfiltration mit anschließender Bebrütung
• Keimzahlbestimmung nach Koch (Prinzip, Ablauf) Koch'sches Plattenverfahren: Methode, mit der Kolonien auf einer Nährbodenplatte gezählt werden Prinzip: Aus MO-Zellen wachsen Kolonien (KBE, CFU) Ablauf: dezimale Verdünnungsreihe Ansetzen der Platten Zählung der KBE (10-300 sind zählbar) Multiplizieren des Zählwerts mit dem Verdünnungsfaktor = KBE Lebendkeimzahl
• Zwei- und Dreiklassen-Prüfpläne (Ablauf, Beispiele) 2-Klassen-Prüfplan: NICHT AKZEPTIERT     -     AKZEPTIERT Nachweis pathogener Keime (Risiko, Sicherheit)   3-Klassen-Prüfplan: NICHT AKZEPTIERT     -      NOCH AKZEPTIERT       -       AKZEPTIERT Aerobe mesophile Gesamtkeimzahl (Qualität, Haltbarkeit)

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