Agrarbiologisches Projekt (Fach) / Infektions- und Umwelthygiene (Lektion)

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• Welche Methoden kennen Sie? direkte Methoden -  Mikroskopie-  kultureller Nachweis /Erregeranzucht- molekularbiologischeMethoden indirekte Methoden - Nachweis von Antikörpern
• Welche Arten der Mikroskopie kennen Sie? - Lichtmikroskopie• zur Differenzierung Färbung notwendig - Fluoreszenzmikroskopie• Markierung mittels Antikörpern - Elektronenmikroskopie• Transmissionselektronenmikroskop oder Rasterelektronen- mikroskop
• Wie funktioniert ein kultureller Nachweis? -  Anzucht und Vermehrung von Erregern auf festen oder in flüssigen Nährmedien -  Differenzierung durch spezielle Nährmedien möglich (Stoffwechsel-eigenschaften, Beweglichkeit) -  Gewinnung von Einzel-/Reinkulturen
• Welche Arten der Molekularbiologischen Methoden kennen Sie? - PCRNachweis speziesspezifischer GeneNachweis von Resistenz- oder Virulenz-Genen - SequenzierungPhylogenetisch stark konservierte Genomabschnitte werden amplifiziert und anschließend sequenziert, Grundlage der modernen Taxonomie (16S rRNA-Gen, rpoB-Gen)
• Wie können Antikörper nachgewiesen werden? ELISA
• Was wissen Sie über den Hintergrund/Geschichte der Infektionsbiologie? - Robert KochEntwicklung der KulturplattentechnikAnzucht von MilzbranderregernHenle-Koch-Postulate - Fanny und Walther HeeseVerbesserung der Qualität fester Nährmedien durch Ersetzen von Gelatine durch Agar-AgarDadurch bessere Anzucht von Bakterien möglich
• Was wissen Sie über den Hintergrund/Geschichte der Infektionsbiologie? - Robert KochEntwicklung der KulturplattentechnikAnzucht von MilzbranderregernHenle-Koch-Postulate - Fanny und Walther HeeseVerbesserung der Qualität fester Nährmedien durch Ersetzen von Gelatine durch Agar-AgarDadurch bessere Anzucht von Bakterien möglich - Antonius van Leeuwenhoekniederländischer Naturforscherbaute Mikroskope von hervorragender Qualitätbeschrieb unter anderem Bakterien im Speichel und Zahnbelag
• Welche Arten der Nährmedien kennen Sie? • feste und flüssige Nährmedien• Universal-, Selektiv-, Indikator- und kombinierte selektive Indikatornährmedien
• Was sind universale Nährmedien? dienen der Anzucht und Vermehrung vieler verschiedener Mikroorganismen enthalten alle zur Anzucht und Vermehrung notwendigen Nährstoffe und Energiequellen Bsp.: Trypton – Soja – Agar, Standard 1 - Agar
• Was wissen Sie über Trypton – Soja – Agar/- Bouillon? universelles, nicht-selektives Nährmedium zur Anzucht vieler Bakterien enthält enzymatisch verdautes Casein und Sojamehl als Nährstoffe und Glukose als Energiequelle
• Was wissen Sie über Selektiv- und Indikatormedien? enthalten Nährstoffe und Energiequellen enthalten zusätzlich selektive Stoffe, die das Wachstum bestimmter Mikroorganismen unterdrücken oder verstärken enthalten Indikatorstoffe, die z.B. die Verstoffwechslung bestimmter Energiequellen anzeigen oft auch als Selektiv- und Indikatornährmedien Bsp.: Columbia – Schafblut – Agar, Gassner – Agar, XLT4 – Agar
• Was ist Columbia Agar mit Schafblut? universelles Kultivierungsmedium enthält Peptone aus pankreatisch verdautemCasein, peptidisch verdautem tierischen Gewebe und Rindfleischextrakt, Hefeextrakt und Maisstärke enthält 5 % Schafblut (Indikator für Hämolyse)
• Was wissen Sie über Gassner Agar? festes Medium zur Differenzierung von Enterobacteriaceae enthält Laktose, Metachromgelb und Wasserblau Fermentierung von Laktose produziert Säuren Metachromgelb dient als Inhibitor für die meisten grampositiven Bakterien Wasserblau dient als pH-Indikator (wird unter sauren Bedingungen blau und unter alkalischen farblos)
• Was ist XLT4 – Agar? selektives Nährmedium zur Isolierung und Differenzierung von Salmonellen ausgewählte Peptone und Hefeextrakt liefern Nährstoffe Lysin, Saccharose, Xylose und Lactose als Energiequellen Tergitol 4 unterdrückt Begleitflora Umwandlung von Thiosulfat zu Hydrogensulfid sorgt in Gegenwart von Eisenionen zur Schwarzfärbung der Kolonien
• Was wissen Sie über Rappaport – Vassiliadis – Bouillon? selektives Anreicherungsmedium für Salmonellen und Shigellen enthält Trypton als Nährstoffquelle, Magnesiumchlorid zur Erhöhung des osmotischen Drucks und Malachitgrün als Inhibitor
• Wie werden Bakterien differenziert? • morphologisch- makromorphologisch - mikromorphologisch • kulturell – biochemisch • serologisch • molekularbiologisch
• Nach was orientiert sich die makromorphologische Differenzierung von Bakterien? KoloniemorphologieGrößeFormFarbeRandProfilVeränderungen des Nährbodens
• Nach was orientiert sich die mikromorphologische Differenzierung von Bakterien? • Mikroskopie• Form• Färbeverhalten
• Wie werden Bakterien kulturell-biochemisch differenziert? Nachweis der Verwertung verschiedener Kohlehydrate Nachweis der Verwertung verschiedener Eiweiße und Aminosäuren Nachweis spezieller Stoffwechseleigenschaften (Gasbildung, H2S-Bildung) Nachweis mittels Indikatorsystemen („bunte Reihe“)
• Wie werden Bakterien serologisch differenziert? • Nachweis spezifischer Antigene mittels spezifischer Antikörper • Objektträgeragglutination• Bsp.: Serotypisierung von Salmonellen
• Was sind flüssige Nährmedien? kein Geliermittel, deswegen bei Raumtemp. flüssig Zur Anreicherung von Mikroorganismen
• Woran erkennt man bebrütete Flüssignährmedien? trübe Färbung
• Was wissen Sie über feste Nährmedien? Zugabe von Agar-Agar -> bei Raumtemp. fest Analyse von MO Beurteilung der Morphologie der Kolonien (Weil MO nicht frei im Medium bewegen können) Quantifizierung möglich -> Kochsches Oberflächenverfahren (1ml in 9ml sterile Kochsalzlösung pipettiert, Wiederholung bis 10^-8, je nachdem zu erwarteten Keimgehalten bei letzten 3 Verdünnungsstufen auf Agar überführt und ausgespatelt, 37°C inkubiert, Interpretation zwischen 30-300 Kolonien berücksichtigt, ermittelte Wert mit Verdünnungsstufe multipliziert um Ausgangskonzentration zu bestimmen) 
• Halbfeste Nährmedien? enthalten Geliermittel jedoch weniger als feste  Zum Nachweis bestimmter Eigenschaften von MO -> z.B. Bewegung durch Flagellen -> Durch Beschichtung kann Umgebung für anaerobe MO geschaffen werden 
• Routinenährböden? Trypton-Soja-Agar Schafblut-Agar (Wachsen anschruchsvoller MO, Bestimmung der Hämolysefähigkeit von MO durch Erythrozyten d. Schafbluts)
• Selektivnährböden? i.d.R. feste Nährböden Durch Zusatz bestimmter Stoffe wird nur Wachstum von MO zugelassen die besondere Eigenschaften besitzen Zusätze: Zucker, Antibiotika, pH-Indikatoren, Farbstoffe, Salze, etc.-> Zucker: nur MO die Z verstoffwechseln können, AB: nur MO die resistent dagegen sind  Differentialnährböden: MO können durch unterschiedliches Aussehen der Kolonien voneinander unterschieden werden-> Beispiele: McConkey-Agar, Gassner-Agar, XLT-Agar-> Zusatz: Farbstoffe, Zucker, pH-Werte-> durch Verstoffwechselung oder pH-Änderung morphologische Veränderung der Kolonien
• Selektivnährböden Bsp? Gassner-Agar -> Farbstoff grün, Differenzierung Gram-neg. Bakt. XLT-Agar -> Farbstoff rot, Differenzierung Salmonellen
• Gassner Agar? Der Nährboden enthält Metachromgelb, Lactose und Wasserblau Metachromgelb hemmt Wachstum der grampositiven Begleitflora (o. grampos. Bakt)-> nur Wachsen von gramneg. Bakterien Lactose als Reaktionskörper, deren Abbau zu Säure durch den Indikator Wasserblau angezeigt wird-> Wasserblau ist im sauren Bereich tiefblau und im alkalischen Bereich farblos. Der zubereitete Nährboden ist grün.-> Im sauren pH-Bereich schlägt seine Farbe nach blaugrün bis blau um. Im alkalischen Bereich tritt dagegen die gelbe Farbe des Metachromgelb zunehmend in Erscheinung. 
• Bakteriologischen Techniken Anlegen v. Kulturen Differenzierung v. Katerien mittels Gram-Färbung kulturell biochemische Tests Nachweis best. Virulenzfaktoren Nach Herausfinden um welches Bakterium es sich handelt-> Antibiogramm 16s-rDNA-Analyse-Verfahren (Verfahren zum Nachweis von Bakterien)
• Wie legt man Kulturen an? Probe mit Krankheit -> welches Bakterium ist verantwortlich? Kultur anlegen: Aus Probe direkt: i.d.R Mischkultur (mit Begleitflora, z.B. Wunde von Haut -> Begleitflora: Haut)Pathogenes MO muss herausgefunden werden  -> dafür muss Reinkultur angelegt werdenwird durch Abnahme verdächtiger Kolonien aus Mischkultur angelegt wenn nicht ausreichend bakterielles Material vorhanden -> in Flüssigmedien Voranreicherung und dann in festen Medien Kultur anlegen 
• Wie wird der 3-Ösen-Ausstrich durchgeführt? Probenmaterial im Zick-Zack auf das obere Drittel der Platte ausstreichen, anschließend Öse verwerfen Platte etwas drehen und mit einer neuen Öse etwas Material des ersten Ausstriches aufnehmen und damit das zweite drittel der Platte ausstreichen, Öse danach vewerfe Noch einmal die Platte drehen und mit einer neuen Öse erneut etwas Material des vorherigen Ausstriches aufnehmen und das dritte Drittel der Platte damit ausstreichen So kommt es bei jedem Ausstrich zu einer Verdünnung des Probenmaterials und es können einzelne Kolonien erkennbar werden
• Wie funktioniert die Gram-Färbung 1? Differenzierung der Bakterien: Methode um Bakterien aufgrund des Zellwandaufbaus in 2 Gruppen einzuteilen (grampos. und gramneg. Bakterien, gramvariable/-labile können nicht untersucht werden), Identifizierung von Kocken und Stäbchen  nach Anfärbung der Bakterien mit einem basischen Farbstoff (Kristallviolett) wird durch Nachbehandlung mit Lugolscher Lösung (enthält einen Iod-Kaliumiodid-Komplex) ein Farbstoff-Iod-Komplex in den Bakterien gebildet  Dieser Farbkomplex ist im Gegensatz zum primären Farbstoff wasserunlöslich. In Ethanol hingegen ist er löslich und wird deshalb aus gramnegativen Bakterien durch Behandlung mit Ethanol extrahiert (rosa/rot)
• Wie werden grampositive Bakterien identifiziert und wieso? Grampositive Bakterien besitzen eine der Zytoplasmamembran aufgelagerte dicke, mehrschichtige „Mureinhülle“ (bestehend aus Peptidoglycanen bzw. „Murein“, können bis zu 50% der Höhentrockenmasse ausmachen, zusätzlich enthält Zellwand 20% und 40% Lipotalchonsäure), deswegen wird Ethanol in Membran nicht extrahiert  In den Zwischenräumen der Mureinhülle sammelt sich die Lugolsche Lösung an. Hier wirkt der Alkohol dehydratisierend und verringert den Abstand zwischen den Molekülen, so dass die Farbstoff-Komplexe nicht vom Alkohol ausgewaschen werden können. Somit bleibt die dunkelblaue Färbung erhalten
• Gramnegative Bakterien? Gramnegative Bakterien hingegen besitzen nur eine dünne, einschichtige Mureinhülle. Diese macht nur etwa 10% der Trockenmasse der Bakterienhülle aus und enthält keine Teichonsäuren. Zudem ist ihr zusätzlich eine zweite Lipid-Membran aufgelagert.  Der Alkohol wirkt lipidlösend, so dass die aufgelagerte Lipidmembran aufgelöst und die dünne Mureinhülle freigelegt wird. Die Farbstoff-Komplexe werden vom Alkohol ausgewaschen – das Bakterium wird wieder entfärbt  Durch Gegenfärbung mit Fuchsin oder Safranin werden die gramnegativen Bakterien dann rot angefärbt.
• Wie differenzieren sich grampos. und gramneg. Bakterien durch Gramfärbung? Positiv = blauviolettNegativ = rot/rosa
• Welche biochemische Tests kennen Sie? Katalase TestCytochromoxidase Test
• Wie können Virulenzfaktoren nachgewiesen werden? Koagulase TestObjektträgeragglutinations-Test
• Wie funktioniert der Katalase Test? Nachweis ob MO Enzym Katalase nachweist oder nicht  Katalase ist ein Enzym, das Wasserstoffperoxid (H2O2) zu Sauerstoff (O2) und Wasser (H2O) umsetztWenn Enzym vorhanden kommt es zur Blasenbildung (durch entweichenden Sauerstoff) Zur Differenzierung grampositiver KokkenPositiv (Blasenbildung) sind z.B Staphylokokken, Negativ sind z.B Streptokokken
• Cytochromoxidasetest? Zur Differenzierung gramneg. Stäbchenbakterien eingesetzt zum Nachweis des Enzyms Cytochrom-C-Oxidase in der Atmungskette von Bakterienoxidiert das reduzierte Cytochrom-C und geht dabei selbst in die reduzierte und inaktive Form In Gegenwart von molekularem Sauerstoff kann das Cytochromoxidase/Cytochrom-C-System einer Reihe von organischen Substanzen Elektronen entziehen (kehrt in aktive Form zurück)-> unter anderem dem Nadi-Reagenz das dabei das Kondensationsmolekül Indophenolblau bildet (Test im Labor) Wenn  Enzym vorhanden kommt es zu einem Farbumschlag nach Blau, das dass die Bakterien Sauerstoff nutzen können, um über eine Elektronentransportkette Energie zu erzeugen Negativ = Enterobacteriaceae -> kein FarbumschlagPositiv = Non-Enterobacteriaceae (z.B. Pasteurella, Procellen) -> blau -> können bakteriellen Sauerstoff nutzen um elektronische Energiekette zu erzeugen
• Wie werden gramnegative Stäbchen-Bakterien differenziert? Cytochromoxidasetest Negativ = Enterobacteriaceae -> kein FarbumschlagPositiv = Non-Enterobacteriaceae (z.B. Pasteurella) -> blau
• Wie werden grampositive Kokken differenziert? Katalase Test Positiv sind z.B Staphylokokken (Blasenbildung)Negativ sind z.B Streptokokken
• Koagulase Test? Nachweis von Virulenzfaktor (Clumping-Faktor)=> Fähigkeit freie oder gebundene Koagulase zu bilden (Clumping-Faktor)wenn in Bakterien vorhanden: kommt zu Aktivierung von Fibrinmonomeren und zur Polymerisation des Fibrins-> Gibt man zu den Bakterien mit Fibrinogen beschichtete Erythrozyten (in diesem Fall Schaf-Erythrozyten) so kommt es zur Agglutination dieser Erythrozyten  Nachweis des Virulenzfaktors : Clumping-Faktor, Bakterium hat die Fähigkeit Koagulase zu bildenz.B. Staphylococcus aureus  wenn verschwommen: neg, Agglutination (Struktur): positiv
• Antibiogramm? = Resistenztest Zur Bestimmung der Empfindlichkeit/Resistenz von mikrobiellen Krankheitserregern gegenüber Antibiotika-> Prüfung ob Bakterium in best. Konz von Antibiotikum in Wachstum gehemmt wird  Wachstumshemmung = Resistenz 2 Arten des Tests: Agardiffusionstest Dilutionsmethoden
• Welche Arten des Antibiogramms gibt es, erklären Sie diese Methoden. Agardiffusionstest:-MO wird auf Oberfläche von Nährboden aufgebracht-Plättchen mit definierter Menge verschiedener Antibiotika werden auf Nährboden gelegt-AB lösen sich im Nährboden und diffundieren radial nach außen-Nach Bebrütung wird der Durchmesser der Hemmhöfe gemessen und ausgewertet ob Antibiotikum wirksam oder resistent Dilutionsmethode:-Aufschwemmung in Flüssigmedium-Zugabe von definierter Menge Antibiotikum-Verdünnungsreihe davon anlegen-Bestimmung der Minimalen-Hemm-Konzentration (MHK) indem man Wert an dem Wachstum des Bakteriums gehemmt wird festlegen kann
• Wie sieht das Ergebnis des Agardiffusionstests aus? Bildung eines Hemmhofes: Bakterium nicht resistent gegen Antibiotika (Antibiotika wirken) kein Hemmhof: Bakterium resistent gegen geprüfte Antibiotika
• Wie wird die minimale Hemmkonzentration bestimmt? Dilutionsmethode Anfertigen einer Verdünnungsreihe des Antibiotikums Trübe Färbung: Nachweis von BakterienwachstumKlar: kein Bakterienwachstum -> diese Probe ist minimale Hemmkonzentration (MHK)
• Diagnostische PCR? Zur Identifizierung von Bakterien 16s-rDNA-Sequenzierung, für die Identifizierung von Bakterien durch Amplifizierung und Sequenzierung Die speziesspezifischen variablen Regionen der 16s-rDNA werden sequenziert (& evtl Aussagen über Quantität treffen) Die 16S rDNA Gene sind innerhalb der Bakterien zu großen Teilen konserviert. Die konservierten und daher einheitlichen Bereichen werden aber immer wieder von Abschnitten, die zwischen den unterschiedlichen Bakterien variieren, unterbrochen-> Durch sequenzieren dieser variablen Regionen erhält man Informationen über die Art der Bakterien, aus denen die DNA isoliert wurde Die Sequenzen der variablen Bereiche sind für die diversen Bakterienspezies in Datenbanken, gelistet und stehen zum Abgleich mit den erhobenen Sequenzdaten und zur Identifizierung der jeweiligen Bakterienspezies zur Verfügung.
• Wie kommt man zu den variablen Bereichen zur Identifizierung der Bakterien durch die Diagnostische PCR? Bakterielles Operon für rDNA ist differenziert in sog. Spacer und 16s rDNA Gen Sequenzabschnitte der 16s rDNA recht stark konserviertwährend nicht trankribierte Abschnitte weisen starke Variabilität auf (zur Identifizierung nützlich)  Definierte Primerpaare der PCR -> kann man in konserviertem Abschnitt des Operons die variablen Regionen des Bakterienisolators überbrücken und amplifizieren und anschließend sequenzieren und auswerten 
• Objektträger Agglutinationstest? Nachweis von Virulenzfaktoren  Für die Differenzierung und Bestätigung Lactose-negativer Bakterien     -> Salmonellen ja/nein Einordnung in Serotypen/Serovare möglichEinordnung über den Nachweis von AntigenenOberflächen-Antigene: H, O, Vi
• Was sind Serovare/Serotypen? Als Serotypen bezeichnet man Untergruppen von Mikroorganismen (z.B. Bakterien, Viren), die sich in ihren antigenen Eigenschaften unterscheiden. Serotypen erlauben die weitere Einteilung einer Erreger-Subspezies, was vor allem aus epidemiologischer Sicht von Interesse ist.

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