80

Agrarbiologisches Projekt (Fach) / Infektions- und Umwelthygiene (Lektion)

Diese Lektion wurde von Monale erstellt.

Lektion lernen

zurück  |  weiter 2 / 2

• Welche Antigene kennen Sie? H-Antigene befinden sich auf den Flagellen oder Geißeln (die Salmonellen aufweisen), diese sind für die aktive Fortbewegung der MO O-Antigene befinden sich auf den Lipopolysacchariden, die auf der Zelloberfläche sind (somatische Antigene) Vi-Antigene sind Kapselantigene, wenn Salmonelle Kapsel auf weist sie auch Vi-Antigene nach
• Wie wird der Agglutinationstest durchgeführt? Zur Identifizierung von Salmonellen, durch Zugabe von Seren geprüft ob und welche Antigene Bakterium besitzt Objektträger auf schwarzen Untergrund legenEin Tropfen des Testserums darauf geben (enthält die Antikörper)Kolonie des Lactose-negativen Bakteriums damit vermischen Positiv: Agglutination (Verklumpung) des Bakteriums mit den Antikörpern des Serums Negativ: keine Agglutination
• Virusnachweismethoden? Darstellung des Virions: Elektronenmikroskopie Virusanzüchtung, Virusisolierung Proteinnachweise-Antigen-Capture-ELISA, Immunfluorenszenz,-Western-Blot-Nachweis von viralen Eigenschaften, z.B. Hämagglutination Nachweis viraler Nucleinsäuren-Southern, Northern oder Dot-Bot, PCR (RT-PCR), in situ Hybridisierung
• Elektronenmikroskopie? macht das Virus sichtbar – Größe, Morphologie große Virusmengen nötig (mind. 10^5 Partikel)
• Wie können Viren vermehrt werden? in lebenden Tierenin embryonierten Hühnereiernin Zellkultur
• Wie können Viren isoliert werden? Anlegen einer Zellkultur -> zytopathischer Effekt -> sichtbar durch Immunfluoreszenz 
• Wie ist die morphologische Entwicklung von Zellkulturen? primäre Fibroblasten -> 3T3, permanente Fibroblasten- Zelllinie -> Hela, permanente Epithelzelllinie
• Was sind zythopatische Effekte? Viele Viren töten ihre Wirtszellen (Lyse). Dadurch können die Zellen sich vom Boden lösen.Insgesamt nennt man sichtbare Veränderungen der Zellen zytopathische Effekte (CPE):
• Wie wirken sich zytopathische Effekte aus? Membranveränderungen Entstehung von Riesenzellen (Synzyzien) Produktion von Einschlußkörperchen (Ansammlungen von Proteine oder Virionen innerhalb der Zelle) Abrundung und Ablösung der Zellen Zelllyse
• Welche Methoden zum Nachweis von Proteinen kennen Sie? (Virusnachweismethoden) Western-Blot, Antigen-Capture-ELISA, Immunfluoreszenz Nachweis von viralen Eigenschaften, z.B. Hämagglutination
• Anzeige
• Wie funktioniert die Virusnachweismethode Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)? Probe mit Virus in Gefäß mit Fang-Antikörper Virus bindet an Fang-Antikörper  Einsatz von Detektionsantikörper (Enzym -> Farbumschlag)
• Wie funktioniert der serologische Virusnachweis? (Serologie = Antigen-Antikörper-Tests im Blutserum) -Immunhistochemie -Immunfluoreszenz
• Wie funktioniert die Hämagglutination? (Virusnachweismethoden) -> beruht auf der Fähigkeit mancher Viren, an rote Blutkörperchen zu binden – Orthomyxoviren – Paramyxoviren bedarf relativ hoher Virusmengen in klinischen Proben kann auch zur Identifizierung eines isolierten Virus beitragen
• Welche Virusnachweismethoden durch virale Nukleinsäuren gibt es? Southern, Northern oder Dot-BotPCR (RT-PCR)in situ-Hybridisierung
• Was ist Virusquantifizierung und wie anhand was wird diese bestimmt? -> Nachweis der Konzentration eines bestimmten Virus – Gesamtvirusmenge1. Virionen 2.virale Proteine3.virales Genom – infektiöse Viruspartikel
• Welche Arten der Infektivitätsprüfung (Virusquantifizierung) gibt es? • Mittlere kulturinfektiöse Dosis KID50 • Ei-infektiöse Dosis EID50 • Letale Dosis LD50 • Pockentest
• Welche Voraussetzungen benötigen Infektivitätstestst? – eine der wichtigsten Eigenschaften eines Virus ist seine Fähigkeit, eine Zelle zu infizieren und sich darin zu vermehren. – Infektiviätstests erlauben die Berechnung eines „Virustiters“. – infektiöse Einheiten werden meist als die kleinste Menge Virus, die einen nachweisbaren biologischen Effekt im Test produziert definiert. 
• Virusverdünnung (Virusquantifizierung)? – exakte Reihenverdünnungen von Virussuspensionen – Verdünnungsmedium ist meist Zellkulturmedium oder Pufferlösung – Reihenverdünnungen werden meistens mit Verdünnungsfaktoren von 2, 5 oder 10 ausgeführt – Verdünnungsstufen werden auf permissive Zellkulturen verimpft
• Wie funktioniert KID50? = diejenige Menge eines Virus, die gebraucht wird, um 50% einer gegebenen Charge beimpfter Zellen zu infizieren – Zellen werden in gesunde Monolayers vermehrt, meist in 96-Loch-Platten, zu denen Portionen der Virusverdünnungsreihe gegeben werden. Je mehr Zellportionen pro Verdünnung infiziert werden, desto genauer wird die Methode. –  nach Inkubation vermehrt sich das Virus. –  CPE entwickelt sich über Tage. Am Ende werden die Zellen unter dem Lichtmikroskop untersucht, jedes Loch der Platte wird auf das Vorhandensein eines CPEs untersucht.
• Plaquetest? => Virusquantifizierung – Plaques: lokalisierte, einzelne, infizierte Bereiche, erkennbar als Zelllyse oder CPE – Plaque Forming Units (PFU): Menge infektiöse Einheiten in eine bestimmte Virussupension – Zellen werden unter einer Agarschicht inkubiert, um eine Ausweitung der Viren in der Zellkultur zu verhindern – es sollten 20 bis 100 Plaques pro Monolayer gezählt werden (kann auch zur Quantifizierung von Bakteriophagen eingesetzt werden!)
• Welche Methode der Virusquantifizierung kann auch zur Quantifizierung von Bakteriophagen eingesetzt werden? Plaquetest
• Welche Möglickeiten der Virusquantifizierung anhand anderer biologisch/chemischer Tests kennen Sie? ‒ Hämadsorption, d.h. Bindung von rote Blutkörperchen an virusinfizierte Zellen ‒ Hämagglutination, d.h. verklumpen von rote Blutkörperchen durch Viren in eine Suspension ‒ Gesamtprotein
• Wie wird die Virusquantifizierung bewerkstelligt? – direkte Zählung von Viruspartikeln im Elektronenmikroskop – molekularbiologische Verfahren: Quantifizierung der Menge an viraler DNA oder RNA in einer Probe - in der Regel ist es wichtig, die Konzentration der infektiösenViruspartikeln festzustellen -> Isolierung der Viren (in Zellkultur)
• Was ist bei der Virusquantifizierung besonders wichtig? • in der Regel ist es wichtig, die Konzentration der infektiösen Viruspartikeln festzustellen-> Isolierung der Viren (in Zellkultur)
• Was sind Infektivitästest? Auf welcher Eigenschaft der Viren basiert diese Methode? – Infektiviätstests erlauben die Berechnung eines „Virustiters“ – eine der wichtigsten Eigenschaften eines Virus ist seine Fähigkeit, eine Zelle zu infizieren und sich darin zu vermehren.
• Wie werden infektiöse Einheiten definiert? = die kleinste Menge Virus, die einen nachweisbaren biologischen Effekt im Test produziert
• Was ist eine Virusverdünnung? Wie funktioniert sie und bei welchem Verfahren wird sie angewandt? – exakte Reihenverdünnungen von Virussuspensionen– Verdünnungsmedium ist meist Zellkulturmedium oder Pufferlösung – Reihenverdünnungen werden meistens mit Verdünnungsfaktoren von 2, 5 oder 10 ausgeführt– Verdünnungsstufen werden auf permissive Zellkulturen verimpft Virusquantifizierung Praktikum: 0,1ml Virusverdünnung in 0,9ml Medium (bis 10^-8)
• Was ist KID50? diejenige Menge eines Virus, die gebraucht wird, um 50% einer gegebenen Charge beimpfter Zellen zu infizieren
• Wie wird KID50 in der Virusquanzifizierung eingesetzt? => diejenige Menge eines Virus, die gebraucht wird, um 50% einer gegebenen Charge beimpfter Zellen zu infizieren – Zellen werden in gesunde Monolayers vermehrt, meist in 96-Loch-Platten, zu denen Portionen der Virusverdünnungsreihe gegeben werden. Je mehr Zellportionen pro Verdünnung infiziert werden, desto genauer wird die Methode. –  nach Inkubation vermehrt sich das Virus. –  CPE entwickelt sich über Tage. Am Ende werden die Zellen unter dem Lichtmikroskop untersucht, jedes Loch der Platte wird auf das Vorhandensein eines CPEs untersucht.
• Wie wird KID50 berechnet? Dies kann nach verschiedene Formeln gemacht werden. Die häufigsten sind nach Reed und Muench und nach Spearman und Kärber.–>  Berechnung des KID50 nach Spearman und Kärber: Log10 KID50 =(X0 –d/2+d∑r/n) berücksichtigt werden die positiven Wells ab der höchsten Verdünnungsstufe, in der alle Ansätze positiv sind. X0 = dek. Logarithmus der höchsten Verdünnung in der noch in alle Wells einen CPE sichtbar istd = log10 des Verdünnungsfaktors (hier: log10 10 = 1) r = Anzahl der positiven Wells pro Stufen = Anzahl der Ansätze pro Stufe Praktikum: Log10KID50 = (6,0 - 1/2 + 1* (8/8 + 2/8 + 1/8) = 6,75KID50 = 106,75 in 100µl => KID50/ml = 107,75  

zurück  |  weiter 2 / 2