Biologie 1 (Fach) / Püschel (Lektion)

Grundlagen der Genetik

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• Das Dogma der Molekularbiologie Replikation: DNA -> DNA Transkription: DNA -> RNA Translation: RNA -> Protein DNA -> RNA -> Protein
• Nucleotide Phosphatgruppe Zucker(Desoxyribose / Ribose) Base(A,C,G,T(U))
• Basen DNA: Purin: Adenin GuaninPyrimidin: Thymin Cytosin   RNA: Purin: Adenin GuaninPyrimidin: Uracil Cytosin
• DNA Polymer aus vier Bausteinen (A = T ; G ≡ C) Doppelhelix mit komplementären undantiparallelen Strängen
• Ein Gen, ein(e) Transkriptionseinheit (ein DNA-Abschnitt, der alsganzes transkribiert wird und die Informationfür ein Protein oder eine RNA enthält )
• DNA-Polymerase (Prok.) Benötigt zur Synthese: 3´OH - Ende und ein Template
• Replikationsfolge: Initiation Elongation Termination
• Genom von Ecoli Ring / zirkulär 4,6mio bp oriC terC
• 1) Initiation Bildung einer Replikationsgabel durch Polymerase am oirC, dadurch -> Bildung einer Replikationsblase DNA-Replikation ist bidirektionell  
• 2) Elongation RNA-Polymerase synthetisiert einen Primer -> 3´OH Ende DNA-Replikation ist diskontinuierlich Leading strand (Leitstrang) läuft in Richtung Replikationsgabel Lagging strand(Folgestrang) läuft in Gegenrichtung Durch den ls entstehen sog. Okazakifragmente
• leading strand kontinuierliche Synthese;nur eine Initiation durch Primase
• lagging strand Synthese in Fragmenten (Okazaki Fragmente)wiederholte Initiation durch Primase
• DNA-Polymerase I (Ecoli) DNA-Reparatur, DNA-Replikationeine Untereinheit mit5'->3' Exonuklease und3'->5' Exonuklease
• DNA-Polymerase III (Ecoli) DNA-Replikation, Core-Enzym aus3 Untereinheiten3'->5' Exonuklease
• Synthese des "lagging strand" 1) Synthese des RNA-Primers durch eineRNA-Polymerase (Primase)2) Verlängerung des RNA-Primers durchDNA-Polymerase III3) Entfernen des RNA-Primers undAuffüllen der Lücke durch DNAPolymerase I4) Verknüpfung der Fragmente durchDNA-Ligase
• Topoisomerase (Gyrase bei Ecoli) Ist für die Entspannungsreaktion, also die Verminderung der Verdrillung der DNA-Stränge zuständig, je nach Enzym gibt es Einzelstrangbrüche (kein ATP verb.) oder Doppelstrangbrüche(mit ATP verbrauch))  
• Helicase Entwindet unter ATP verbrauch den Doppelstrang, wodurch sich ZWEI Replikationsgabeln ergeben, welche in entgegengesetzte Richtungen laufen. SSB´s = singel-strand-binding-proteins,sorgen dafür, dass sich die DNA nicht wieder zusammenlagern kann
• DNA-Polymerase III 3 Untereinheiten: α - Untereinheit: Katalytischer Core τ - U.e. : Dimerisation β- U.e.: Prozessivität ("clamp") γ - Komplex(5Proteine):Assemblierung β-Ring auf DNA ("Clamp-loader")
• DNA-Polymerase Holoenzym 2 α-Untereinheiten: katalytischer Core2 τ-Untereinheiten: Dimerisation2 β-Untereinheiten: Clamp 1 γ-Komplex: "Clamp-loader"
• DNA-Replikation ist: 1) Semikonservativ2) Bidirektional3) Diskontinuierlich
• Transkription I: Prokaryonten RNA-Polymerase: DNA-abhängige RNA-Polymerase;RNA-Polymerasen kopieren den codierenden Strang-> Transkript = mRNA Promotor: Sequenzen, die es der Polymeraseerlauben den Anfang des Gens zu erkennen Terminator: Sequenzen, die es der Polymeraseerlauben das Ende des Gens zu erkennen
• Promotor Wird von der RNA-Polymerase erkannt und ist somit die Erkennungsstelle für ein Genanfang -35 Region -10 Region (TATA- oder Pribnow-Box) UP(upstream)-Element: stromaufwärts der -35 Region (AT-reich)
• Sigma-Faktor erlaubt die Erkennung der Promotor-Region Eine vollständige bakterielle Polymerase mit gebundenem Sigma-Faktor wird oft auch als Holoenzym bezeichnet Sigma-Faktoren weisen eine hohe Affinität zur Pribnow-Box und der -35-Sequenz des Promotors auf Damit erhöht sie die Bindewahrscheinlichkeit des Polymerase-Holoenzyms an die Startstelle des offenen Leserahmens der DNA Wenn das Polymerase-Holoenzym den offenen Komplex bildet und die Transkription beginnt, wird der Sigma-Faktor abgespalten.
• Eukaryotische Promotoren RNA Polymerase I generiert rRNA (ribosomale RNA), RNA Polymerase II generiert mRNA und snRNA (small nuclear RNA) RNA Polymerase III generiert tRNA, snRNA und 5S rRNA. Jede RNA-Polymerase interagiert wiederum mit jeweils verschiedenen Transkriptionsfaktoren, und erkennt für jede Polymerase spezifische Bindungsstellen für Transkriptionsfaktoren, den Promotorbereich selbst und URS (upstream regulatory sequences). Weiterhin ist die Zahl der allgemeinen Transkriptionsfaktoren bei Eukaryoten deutlich größer als bei Bakterien. Am Promotor können sich dem nach eigene Initiationskomplexe bilden, die die Transkription positiv oder negativ beeinflussen können. Dies ist der Grund für die Vielfalt der Promotorsequenzen, die von einer bestimmten RNA-Polymerase im Zusammenspiel mit den jeweiligen Transkriptionsfaktoren erkannt werden können.
• Termination Zwei Mechanismen der Termination in E. coli 1) Rho-unabhängige Termination: "Stem-Loop"-Strukturder mRNA, bei der Mehrzahl der E. coli Gene zu finden2) Rho-abhängigen Termination: Bindung des Rho-Proteinan die mRNA führt zur Termination
• polycistronische mRNA vorkommen in Prokaryonten mehrere Gene werden auf ein Transkript kopiert die einzelnen Proteine entstehen erst am Ribosom Bsp: Lac-Operon-Modell  
• Enzyme des Lactose-Stoffwechsels β-Galactosidase lacZ Lactose-Permease lacY Transacetylase lacA in Lactose-freiem Medium nicht exprimiertLactose als einzige C-Quelle: -> Induktion der Enzyme   von einem Promotor transkribiert: Plac
• Das Lac-Operon Pi : Promotor des Lac-RepressorlacI: Gen für Lac-Repressor ____ !Regulatorgen! Plac : Promotor des lac-OperonsOlac : OperatorlacZlacY  =    StrukturgenelacA In Abwesenheit des Induktors (Lactose) bindet derLac-Repressor an den Operator und reprimiert das Lac-OperonDie RNA-Polymerase wird daran gehindert dieStrukturgene zu transkribierenDer Induktor bindet an den Lac-Repressor ->KonformationsänderungDer Repressor ist nicht mehr in der Lage denOperator zu binden ->RNA-Polymerase kann die Transkription initiieren  
• Lac-Repressor Dimere bilden eine funktionelle Einheitzwei Dimere -> Tetramer modularer Aufbau: DNA-Bindungsdomäne flexibler Linker Induktor-Bindung Tetramerisierung tetramerer Lac-Repressor kann zwei Operator-Sequenzengleichzeitig binden, für vollständige Repression notwendig-> DNA-Schleife Lac-Operon: Zwei intakte Operatoren für vollständige Repression notwendig
• Katabolit-Repression Glucose-Repression derLactose Verwertung.In Anwesenheit von Glucose wird daslac-Operon nicht transkribiert. Katabolismus = Abbauende Prozesse; Von höherwertigen zu niederwertigen Molekülen Signal: cAMP (Adenosin-3'-5'-Monophosphat)cAMP bindet an CAP (catabolite activator protein)= CRP (cAMP receptor protein)cAMP-Bindung -> KonformationsänderungCAP•cAMP erkennt DNA-Sequenz 5' des lac Operators CAP•cAMP fördert die Bindung der RNA Polymerase anden Promotor des lac Operons Ist Glucose vorhanden: inaktive Cyclase geringe cAMP-Konzentration;wenn nicht: aktive Cyclase hohe cAMP-Konzentration lac Operon nur aktiviert wennGlucose fehlt UND Lactose vorhanden ist  
• Operons ermöglichen koordinierte Regulation von Genen positive Kontrolle:Aktivierung des Promotors durch CAP•cAMP negative Kontrolle:Repression des Promotors durch lac-Repressor
• Trp-Operon Pi : Promotor des Trp-RepressortrpR: Gen für Trp-Repressor RegulatorgenOtrp: trp OperatorPtrp :Promotor des trp-Operons trpEtrpDtrpC    StrukturgenetrpBtrpA Pi + trpR: Repressor wird transkribiert,ebenso die Strukturgene. Ist das Stoffwechselwegendprodukt in erhöhtem Maß vorhanden, hier Tryptophan, dient es als Korepressor. Dieser bindet an den Repressor, wodruch dieser aktiviert wird und sich an den Operator bindet, wodruch dieser blockiert wird. Nun werden keine Strukturgene mehr transkribiert.
• Lac-Operon vs. Trp-Operon Lac-Operon ________________Trp-Operon Lac Repressor______________ Trp RepressorInduktor: Allolactose__________Korepressor: Tryptophan Induktion__________________ Repression Induktor verhindert____________Korepressor induziertBindung an Operator___________Bindung an Operator
• Translation in Prokaryoten DNA- und Proteinsequenz sind kolinear Ein Triplett (Codon) -> eine Aminosäure Start und Stop Codon legen Anfang und Endeder kodierenden Region fest Open Reading Frame (ORF) (offenes Leseraster)
• RNA bei der PBS RNA übernimmt drei verschiedene Rollen bei derProteinbiosynthese (Translation): 1) mRNA: Anweisung für die Art und Reihenfolge der Aminosäuren 2) tRNA: entziffert mRNA und trägt die Aminosäuren3) rRNA: bildet zusammen mit Proteinen die Ribosomen, die Proteinsynthesemaschine
• Aminoacyl-tRNA-Synthetase Vernüpfung von Aminosäure und tRNA,mindestens 20 verschiedene Enzymeeines für jede Aminosäure tRNA + Aminosäure +ATP → Aminoacyl-tRNA  
• Prokaryotische Ribosomen 70S 50S-Untereinheit: 23 S, 5 S rRNA 30S-Untereinheit: 16 S rRNA 60% RNA40 % Protein
• Translation: Initiation: Sequenz im 5'-nichtcodierenden Bereich der mRNA: Shine-Dalgarno-Sequenz(AGGAGGU) -> wird von der Ribosomen-Bindungsstelle erkannt(16 S rRNA) Elongation: tRNAs bringen die passenden AS zum Ribosom, von welchem diese miteinander zur Polypeptidketten verknüpft werden Termination: Ein StopCodon, zu welchem es keine passende tRNA gibt, verschlüsselt das Ender der Translation  
• Shine-Dalgarno-Sequenz Die Shine-Dalgarno-Sequenz ist eine Sequenz der mRNA bei Prokaryoten, die als Teil der ribosomalen Bindungsstelle (RBS) von den Ribosomen erkannt wird und damit den Startpunkt der Translation markiert   Bei Eukaryoten übernimmt die Kozak-Sequenz die Funktion der Shine-Dalgarno-Sequenz.
• Initiationsfaktoren verhindern die vorzeitige Bindung der 50 S Untereinheit
• Elongationsfaktoren sorgen für den geordneten Ablauf der Elongation
• Expression von rekombinantem Insulin in Bakterien Protein → DNA Sequenz → Expression in Bakterien Dazu benutzt man: Eco RI , diese ist eine Endonuclease, die einepalindromische Sequenz erkennt:----GAATTC--------CTTAAG---- und hier "sticky ends" schneidet. Hier kann man nun die gewünschte DNA-Sequenz einbringen, und synthetisieren lassen. Methylierung der Erkennungssequenz GAATTC durchdie EcoRI-Methylase blockiert die Hydrolyse durch Eco RI  
• Klonierungsvektoren Plasmide: episomale (= extrachromosomale Elemente)autonom replizierende zirkuläre DNA-Moleküle F-Plasmid: enthält Gene für Übertragung vonDNA-Molekülen zwischen BakterienR-Plasmid: enthält zusätzlich Gen für Antibiotika-Resistenz Klonierungsvektor: Origin of replication Selektierbarer Marker (Antibiotika-Resistenz) Region zur Insertion fremder DNA  
• Transposon: ein mobiles genetisches Element, das anbeliebigen Stellen eines Genoms inserieren kann
• (nicht)replikative Transposition replikative Transposition: das Transposon wird kopiert, die Zahl der Transposons nimmt zu nicht-replikative Transposition: das Transposon wird als Einheit bewegt, die Zahl der Transposons bleibt konstant
• Bakteriophagen virulente Phagen(zb. T4): Infektion hat immer Zellyse zur Folgetemperente Phagen(zb. λ-Phage): neben lytischer VermehrungLysogenisierung als alternativer Vermehrungsweg  
• Chromatin: Heterochromatin: inaktives ChromatinEuchromatin: aktives Chromatin
• Genom bei Eukrayoten Das Genom der Eukaryoten ist linear 1) Genom in Chromosomen unterteilt2) Zellteilung: DNA wird kondensiert 1 Chromosom: eine DNA-Doppelhelix: * ↑=======--===========↑*Telomer Centromer Telomer  
• Zellzyklus: Der Zz besteht aus Interphase(Zwischenphase) und Mitose(Kernteilung). Die Interphase wiederum teilt sich auf in folgende Abläufe:G1-Phase:Nach der Mitose, wächst die Zelle hier und Zellbestandteile werden ergänzt. Die Zelle bereit sich auf die S-Phase vor, daher werden mRNA für Histone und Replikationsenzyme produziert. S-Phase: Hier wird die DNA-Repliziert, produktion von Histonen. Danach hat jedes Chromosom zwei Chromatiden G2-Phase: Das ER wird eingeschmolzen, die Zelle breitet sich auf die Mitose vor. Zellkontakte werden gelöst und die Zellen runden sich durch Wassereinlagerungen ab. Zudem wird verstärkt RNA und zellteilungsspezifische Proteine hergestellt. M-Phase: Teilung der Chromosomen, des Zellkerns(Karyokinese), und der Zelle(Zytokinese). G0-Phase: Ruhephase, ausdifferenzierte, sich nicht mehr teilende Zellen, verbleiben in der G1, welche dann als G0 bezeichnet wird. Manche Zellen können wieder in die G1 zurückkehren(zb Leberz.)  
• Mitose Gliedert sich in 5 Phasen: Prophase: Trennung der Zentrosomen und wanderung zu den Zellpolen. Das Chromatin verdichtet sich, Chromosomen werden sichtbar Prometaphase: Zerfall der Kernhülle, Chromosomen sammeln sich in der Zellmitte. An den Centromeren der Chromosomen setzen sich die Kinetochore fest, welche die Bindungsstelle für die Mikrotubuli des Spindelfaserapperates darstellen Metaphase: Ausrichtung der Chromosomen in der Äquatorialebene durch den Sfa, die Phase endet, wenn alle Chromos dort angekommen sind Anaphase: Auseinanderziehen der Schwesterchromatiden durch den Sfa zu den Zellpolen Telophase: Im sofortigen Anschluss an die Anaphase, werden hier die Kinetochorphasern depolymerisiert, die Kernhülle bildet sich und die Chromosomen dekondensieren, wonach sich die Zelle wieder in der Interphase befindet. Nach der Telophase kommt die Zelle in die Zytokinese, wo die Zellbestandteile aufgeteilt werden.

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