Zelldynamik (Subject) / Mikrotubuli (Lesson)

This lesson was created by MichaelJGass.

Learn lesson

This lesson is not released for learning.

back  |  next 1 / 1

• Wie heißen die drei Typen von Filamenten, welche das eukaryontische Zytoskelett bilden? Ordnen Sie diese nach der Dicke der Filamente an, beginnend mit den Dünnsten. Aktinfilamente (Mikrofilamente) mit ca. 7nm < Intermediärfilamente mit ca. 10nm < Mikrotubuli mit ca. 25nm
• Geben Sie Beispiele für Mikrotubuli-vermittelte Zellmotilität. Intrazellulärer Transport von Vesikeln und Zellorganellen Bewegung von Zellen mit Hilfe von Cilien und Geißeln Trennung der Chromosomen während der Mitose Intraflagellarer Transport
• Von wem und Wann wurden mikrotubuläre Strukturen zuerst entdeckt Die ersten Entdeckungen kamen mit der Einführung der Elektronenmikroskopie in den Biowissenschaften in den 50er und 60er Jahren, in dessen Zuge viele Organismen so in höherer Auflösung charakterisiert werden könnten. Die Wissenschaftler Slaughterbeck, sowie Ledbetter & Porter entdeckten 1963 bei der mikroskopischen Untersuchung von Spindel "Fibrillen", der Cortex von Pflanzenzellen und Hydren, dass es sich bei den beschriebenen "Fibrillen" um ein und den selben Typ handelt und nannten diese "Mikrotubuli". Die Identifizierung des verantwortlichen Proteins Tubulin folgte 1968.
• Nennen sie Methoden zur strukturellen Aufklärung von Mikrotubuli. Ultradünnschnitte > Aufbau aus 13 Protofilamenten Lichtmikroskopie (VEDIC, video enhanced differential interference contrast) Transmissionselektronenmikroskopie TEM > Schrägbedampfung TEM > Whole-Mount Negativkontrastierung mit Uranylacetat (UAc) > Entdeckung von Doppeltubuli aus Geißel
• Beschreiben Sie den Aufbau von Mikrotubuli. gerichtete Strukturen, deren Enden wegen ihrer Polymerisationsrichtung mit Polymerisationsrichtung > plus und minus - Enden Einheiten (Dimere) aus je einem Molekül α- (negativ) und β-Tubulin (positiv) > Heterodimere ohne kovalente Bindung Dimere bilden durch längsgerichtete Verknüpfung Subfilamente (sogenannte Protofilamente), von denen meist 13 in seitlich an Wand der Mikrotubuli verknüpfte Protofilamente bilden ein "singulet MT" typischerweise mit ihrem minus-Ende (über das α-Tubulin) an ein Mikrotubulus-Organisationszentrum (MTOC) gebunden, welches γ-Tubulin enthält Tubuline verschiedener Organismen sind nicht identisch > Variation in Durchmesser der zwischen 20 und 30 Nanometer es gibt singulet (13 Protofilamente), Duplett (MT A, 13 Protofilamente + MT B, 10 Protofilamente), Triplett (MT A, 13 Protofilamente + MT B, 10 Protofilamente + MT C, 10 Protofilamente)
• Wo finden sich Duplett-Tubuli und Triplett-Tubuli? Duplett-Tubuli (MT A13 + MT B10) > nur in Axoneme > in eukaryotischen Zilien, z.B. Spermiengeißel Axonem: Neun periphere Doppelmikrotubuli (A- und B-Tubuli mit inneren und äußeren Dynein-Armen) umgeben zwei einzelne, zentrale Mikrotubuli in der Mitte ("9x2+2"-Struktur) Triplett-Tubuli (MT A 13 + MT B 10 + MT C 10) > nur in Basalkörperchen und Centriolen
• In welche Phasen lässt sich die Polymerisation von Mikrotubuli unterteilen? Die Bildung von Mikrotubuli kann in 3 Phasen unterteilt werden. Die Wachstumskinetik kann mit der exponentiellen Wachstumskurve von sich zweiteilenden Bakterien verglichen werden. Lag-Phase > Nukleation Wachstumsphase > Untereinheiten werden aneinander gelagert Equilibrium-Phase > Polymerisation und Depolymerisation stehen im Gleichgewicht
• Von welchen Faktoren ist die Polymerisation von Mikrotubuli abhängig? Die Polymerisation ist von folgenden Faktoren abhängig: Konzentration der Alpha- und Beta-Tubulindimere der Temperatur:     Abkühlen auf 4°C > Depolymerisation von MTs zu Dimeren > Erwärmen auf 37°C > Polymerisation von Dimeren zu MTs  
• Erklären sie die dynamische Instabilität von Mikrotubuli. EM Untersuchungen von in vitro polymerisierten MTs > Die Anzahl von MT pro ml nehmen mit der Zeit während reziprok die durchschnittliche Länge der MT (μm) >> Zahl der MTs nimmt mit der Zeit ab, aber die Länge nimmt zu >> Verkürzung und Wuchs gleichzeitig in einer Population
• Was versteht man unter der dynamischen Instabilität von Mikrotubuli? Unter dynamischer Instabilität versteht man den dynamischen Auf- und Abbau von Mikrotubuli. Mikrotubuli besitzen ein positives Ende am Rand der Zelle (Zellperipherie) sowie ein negatives Ende im microtubule organizing center (MTOC) nahe dem Zellkern. geeigneten Bedingungen > Anlagern von einzelnen Tubulinmolekülen mit fest gebundenem Guanosintriphosphat (GTP) an das positive Ende der Mikrotubuli > Wachstum (Polymerisation) wodurch diese wachsen (Polymerisation). Nach kurzer Zeit wird das GTP per Hydrolyse zu Guanosindiphosphat (GDP) abgebaut. GDP bleibt an das Tubulin gebunden. Kappe aus GTP-Tubulinen auf der positiven Seite der Mikrotubuli, auf die in Richtung des negativen Endes eine lange Kette aus GDP-Tubulinen folgt Hydrolyse von GTP zu GDP schneller als neues GTP-Tubulin gebunden wird > Abbau (Depolymerisation) GTP des letzten Tubulinmoleküls zerfällt in der Kette zu GDP Mikrotubulus depolymerisiert rapide (engl. catastrophe) Depolymerisation wird erst dann unterbrochen, wenn ein neues GTP-Tubulin an den zerfallenden Strang bindet und sich eine neue GTP-Tubulin-Kappe ausbildet (engl. rescue)
• Advertisement
• Wovon ist die Dynamik in der Polymerisation und Depolymerisation von MTs (dynamische Instabilität) abhängig? Es wird von der Konzentration von GTP-gebundenen Tubulinen abhängig, die sich an das Plus-Ende des MTs anlagern. Wenn dies schneller geschieht als die intrinsische Hydrolyse von Tubulin-gebundenen GTP zu GDP, so entsteht am plus-Ende eine GTP-Kappe und der MT wächst. Bei ausreichend hoher Konzentration an GTP Tubulin bleibt das Wachstum stabil, da die Polymersation am plus-Ende höher ist, als am minus-Ende und die entsprechende Depolymerisation. Sinkt die Konzentration an GTP Tubulinen allerdings unter eine kritische Konzentration, sodass die Hydrolyse schneller fortschreitet und am Ende am Plus-Ende das letzte GTP Tubulin zu GDP Tubulin hydrolysiert wird, so findet eine Katastrophe statt und das MT löst sich rapide auf. Erst wenn wieder ein GTP Tubulin an das plus-Ende bindet, so startet wieder das Wachstum, wobei man von einem "Rescue" spricht.
• Erläutern sie die Polymerisation von Mikrotubuli (in vitro)? Die Polymerisation erfolgt in 3 Schritten: Protofilament assembly Sheet assembly Microtubule elongation Mikrotubuli haben eine strukturelle und funktionelle Polarität Mikrotubuli wachsen an ihrem + Ende schneller als an ihrem - Ende Mikrotubuli sind sehr dynamisch und können ihre Länge durch Polymerisation, Depolymerisation sehr schnell verändern
• Nennen sie die verschiedenen, bekannten Tubuline und deren Funktion. α- und β-Tubulin: Alpha & Beta-Tubulin; „Bausteine“ der Mikrotubuli γ-Tubulin: Gamma-Tubulin; Nukleation von Mikrotubuli > Bildung des γ-Tubulin-Ring-Komplex und Markieren des - Ende von MT δ-Tubulin: Delta-Tubulin; Wichtig für die Bildung von Mikrotubuli-Triplets ε-Tubulin: Epsilon-Tubulin; Beteiligung bei der Assemblierung von Basalkörpern / Centriolen ζ-Tubulin: Epsilon-Tubulin; Beteiligung bei der Assemblierung von Basalkörpern / Centriolen η-Tubulin: Eta-Tubulin ??? ι-Tubulin: Iota-Tubulin ???
• Was versteht man unter "Fluorescence-speckle-microscopy" und wozu wird diese im Studium der Mikrotubuli genutzt? Welche Eigenschaften von Mikrotubuli können durch diese Technik beschrieben werden? Quelle: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21536774 Eine fluoreszenz-basierte Mikroskopie-Technik, deren Bildgebung es in Echtzeit erlaubt, qualitativ, sowie quantitative die Bewegungsabläufe und dynamischen Turnover von makromolekularen Komplexen in vivo als auch in vitro zu analysieren. Der Unterschied zu alternativen Techniken wie "Photobleaching" oder "Photoaktivierung" besteht darin, dass mit wesentlichen geringeren Konzentrationen an fluoreszens-markierten Untereinheiten des zu untersuchenden komplexen Strukturen gearbeitet wird. Die wenig fluoreszierenden UE zufällig zusammen einer Überzahl aus nicht-fluoreszierenden UE in die makormolekularen Strukturen inkooperiert werden, dann erscheinen unter dem Mikroskop ein zufällig verteiltes Muster aus "punktförmigen" Fluorophor-generierten Signalen im Kontrast zu den nicht-markierten UE, anderen Strukturen mit geringer Hintergrund-Fluoreszens, als sog. "speckles". Das Verhalten der "speckles" fungieren als Marker, um die Bewegung und den Turnover der UE und somit der auch gesamten Struktur zu visualisieren. Damit können bei Mikrotubuli die Mechanismen des "Treadmilling", als auch der "dynamischen Instabilität" nachgewiesen werden.
• 1. Was ist der γ-Tubulin-Ring-Komplex? 2. Wie wird er gebildet (Theorien)? 3. Wie sind GammaTuRC organisiert? 4.Mit welcher mikroskopischen Methode können diese Komplexe sichtbar gemacht werden? 1.  Dieser sogenannte „Gamma-Tubulin-Ring-Complex“ (gammaTuRC) kann die Polymerisation von alpha- und beta-Tubulin zur Bildung von Mikrotubuli, ausgehend vom Zentrosom, bewirken.Er ist an der Keimung neuer Mikrotubuli am Zentrosom und den Basalkörpern beteiligt. Gamma-Tubulin bildet dabei einen großen ringförmigen Proteinkomplex mit weiteren Proteinen. 2. Er wird aus 12 Kopien des Gamma-Tubulin und multiplen Kopien diverser anderer an das Gammatubulin, assoziierter Proteine (Dgrip 84, 75s, 91, 128, 163-9) gebildet. Wie dies genau geschieht wird in der Wissenschaft noch diskutiert. Es existieren 2 Theorien darüber, wie der gammaTuRC mit MTs interagiert. Die Theorie beschreibt, wie das y-Tubulin als GammaTuRC (Ring) am Minus-Ende von MT assoziiert und als Matrize die Nukleation des MT markiert und dessen Polymerisation zum Plus-Ende des MT ausrichtet. Das - Ende des MT wird dabei dabei durch den GammaTuRC deaktiviert. Die andere Theorie beschreibt die Struktur des Gammatubulins als Protofilament, welches in das Minus-Ende des MT inkooperiert wird. 3. γ-Tubulin.Ring-Komplex sind in MTOCs (MTOC=Microtubulle-Organizing Center) organisiert. Diese sind am Centrosom lokalisiert. Von dort aus polymerisieren MTs mit ihren Plus-Ende voraus in die Zellperipherie aus.
• Welche Rolle spielt δ-Tubulin und wie wurde diese experimentell nachgewiesen? Das δ-Tubulin spielt eine wichtige Rolle bei der Bildung von Mikrotubuli-Tripletts, welche in Basalkörperchen und Centriolen vorkommen. Die Deletion des δ-Tubulin Gens in Chlamydomonas führt zu einer abnormen Ultrastruktur der Basalkörper; diese bestehen nicht mehr aus MT-Triplets, sondern vorwiegend aus MT-Duplets. Die Deletion ist jedoch nicht lethal.
• Welche Rolle spielt ε-Tubulin? ε-Tubulin spielt eine wichtige Rolle bei der Bildung von Basalkörpern/Centriolen. Lokalisationstudien mittels Fluoreszensmikrokopie konnte zeigen, dass sich dessen Position nahe um die Basalkörper befindet. Es existiert ein Modell, welches ε-Tubulin als ein "Gerüst" rund um den Basalkörper beschreibt. Der Mechanismus ist jedoch unbekannt und das Modell nicht bestätigt, da nötige Deletion des Gens für die Zellen lethal ist.
• Das Tubulincytoskelett ist ein sehr komplexes und dynamisches System. Es bildet in verschiedenen Zellen und zu verschiedenen Zeiten sehr unterschiedliche Strukturen. Wie wird das ermöglicht? 1. Die besonderen Polymerisationseigenschaften von Tubulin (Dynamische Instabilität). 2. Tubulin bindende Proteine (MAPs; Microtubule associated proteins)
• Welche Rolle hat das MAP Op13/stathmin ? Op13 bzw. stathmin wird als "MT-destabilisierendes MAP" klassifiziert. Es bindet an Tubulindimere und/oder fördert Katastrophen (rapider Depolymerisation des MT) Zwei Mechanismen werden für die MT-destabilisierenden Eigenschaft von OP18/stathmin vorgeschlagen: 1. OP18/stathmin bindet Tubulindimere und senkt so deren intrazelluläre Konzentration. Dadurch wird die Polymerisationsgeschwindigkeit an beiden Enden des MT gesenkt und die Rate von Katastrophen erhöht. Dies kann 2. OP18/stathmin fördert Katastrophen am + Ende, eventuell durch Stimulation der GTP-Hydrolyse im beta-Tubulin. Die GTP Kappe wird abgebaut und es kommt zur Katastrophe (rapide Depolymerisation des MT) Anhand der relevanten Studien ist es wahrscheinlich, dass beide Theorien gleichzeitig zutreffend sind und miteinandern Katastrophen fördern, indem sie diese verursachen und zweitens den Rescue-Event verhindern, indem OP18/stathmin freie GTP-gebundene Tubulindimere binden und so an der Bildung einer neuen GTP-Kappe hindern.
• Nennen die die diversen Klassifizierungen von MAPs und geben sie je Beispiele. Mikrotubuli-assoziierte Proteine a) Motorproteine: Kinesine, Dyneine b) Nicht-Motorproteine (nach Funktion klassifiziert): MT-destabilisierend: Op18/stathmin > Bindet Tubulindimere und/oder fördert Katastrophen MT-durchtrennend: Katanin > ATP-abhängige Durchtrennung von MT MT-stabilisierend: MAP1A, MAP1B, MAP2, MAP4 > fördert Stabilität
• Nennen sie die Klassifizierung von MAPs und nennen sie ein Beispiel und dessen Funktion. Motorproteine: Kinesin > Transport von Vesikeln/Organellen vom - Ende zum + Ende von MTs Dynein > Bewegt sich vom + Ende zum - Ende von MTs beide haben eine ähnliche Proteinstruktur aus 2 globulären Kopfdomänen, die an den MT binden können und einer Schwanzdomäne zum Binden von Vesikeln und Zellorganellen zum intrazellulären Transport entlang von MT Nicht-Motorproteine (nach Funktion klassifiziert): MT-destabilisierende MAPs: OP18/stathmin > bindet Tubulindimere, fördert Katastrophen MT-durchtrennende MAPs: Katenin > ATP-abhängige Durchtrennung von MT MT-stabilisierende MAPs: MAP1A, MAP1B, MAP2, MAP4 > Fördert MT Polymerisation, Tau stabilisiert und fördert Polymerisation (< relevanz in Alzheimer); Tektin > Stabilisiert MT in Axonemen und Centriolen MT-verbindend: MAST > verbindet Kinetochoren mit + Ende MT; CLIP-170 > verbindet Endosomen mit den + Ende von MT  + TIPs (+ End tracking proteins): EB1 > stabilisiert MT; CLIP-170 > verbindet Endosomen mit den + Ende von MT
• Welche Aufgaben können verschiedene Kinesine und Dyneine wahrnehmen? cytosolische Motoren: Transport von Organellen und Vesikeln Kinesin I + II; KIF1A, KIF1B; cytosolisches Dynein      2. mitotische Motoren: Trennung von Chromosomen während der Mitose Kinesin BimC Chromokinesine MCAK CENP-E Kinesin Ncd Cytosolisches Dynein [...]      3. Axonemale Dyneine: Schlag der Geissel und Cilien Outer und Inner-Arm Dyneine
• Was ist Katanin und was tut es? Katanin durchtrennt Mikrotubuli und gehört zu der Gruppe der AAA-Proteine, der ATPase assoziierten Proteinen mit diversen zellulären Aktivitäten. Zuerst entdeckt in Seeigeln. Katanin bildet einen Heterodimer: Es beinhält eine 60 kDa Untereinheit mit ATPase-Aktivität, welche funktional zum Durchtrennen von Mikrotubuli dient. Diese Untereinheit wird durch ATP und das Vorhandensein von Mikrotubuli aktiviert. Die zweite Untereinheit des Heterodimers von etwa 80kDa reguliert die Aktivität der ATPase und lokalisiert das Protein zu den Zentromeren. Es konnte elektronenmikroskopisch gezeigt werden, dass Katanin in seiner aktivierten Form Ringe einer Größe von 14-16nm an den Wänden von Mikrotubuli bildet.
• Was ist KATANIN? Wie ist es aufgebaut? Katanin durchtrennt Mikrotubuli. Katanin wurde zuerst in Seeigeln entdeckt. Katanin ist ein heterodimeres Protein aus der Familie der AAA-Proteine, der ATPase assoziierten Proteine mit diversen zellulären Aktivitäten. Als Heterodimer besteht es aus einer Untereinheit von 60kDa, welches eine ATPase Funktion aufweist. Diese wird bei Vorhandensein von ATP und Mikrotubuli aktiviert. Die zweite Untereinheit hat eine Größe von 80kDa und dient der Regulation der ATPase-Aktivität und der Lokalisierung des Proteins an den Zentrosomen. Weiterhin konnte elektronenmikroskopisch gezeigt werden, dass Katanin in seiner aktivierten Form Ringe einer Größe von 14-16nm an den Wänden von Mikrotubuli bildet.
• Erläutern sie den Mechnismus der Wirkweise von Katanin! Hexamerer Katanin-Komplex (Katanin-ATP) bildet einen Ring um den Mikrotubulus Ist der Ring komplett, kommt es zur Hydrolyse des ATP und Freisetzung von Pi; eine Konformationsänderung des Katanins führt zu einer Destabilisierung der Tubulin-Tublin Kontakte. ADP-Katanin hat eine geringere Affinität für Katanin und Tubulin, der hexamere Katanin-Komplex dissoziiert vom Mikrotubulus Durch die Destabilisierung der Tubulin-Tubulin
• Beschreiben Sie einen in vitro Assay zur Feststellung der Katanin-Aktivität. Dies lässt sich biochemisch mit anschließender Fluoreszenzmikroskopie feststellen. In vitro wird die Bildung von fluoreszenzmarkierten Mikrotubuli katalysiert (GFP-Alpha bzw. Beta-Tubulin). Es werden fluoreszensmikroskopisch Bilder aufgenommen, die als Kontrolle von T0 und zur Kontrolle der ordentlichen MT-Polymerisation dienen. Anschließend wird Katanin und ATP zugegeben und nach 3 Minuten wieder ein Präparat für die Fluoreszensmikroskopie angefertigt. Die zuvor als Mikrotubuli sichtbaren Strukturen sind nun mehrfach durchtrennt und es sind nur noch wesentliche kleinere miktrotubuläre Strukturen sichtbar.
• Nennen sie mögliche in vivo Funktionen von Katanin Freisetzung von Mikrotubuli vom Centrosom Polwärts gerichtete Bewegung von Mikrotubuli bei der Mitose Beispiele: Die Alge Chlamydomonas ist in der Lage ihre Geißeln abzuwerfen, z.B. bei Exposition der Zelle zu Säuren. Molekular ist das so zu erklären, dass Katanin in der Übergangszone über der Centrinfibrillen lokalisiert ist. Beim Geißelabwurf wirken Katanin und die Kontraktion der Centrin-Fibrillen der Übergangsregion zusammen.

back  |  next 1 / 1