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Biochemie ELW (Subject) / Laborpraktikum Biochemie (Lesson)

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• Versuchsziel: Entwicklung von Röntgenfilmen Sichbarmachung der spezifischen Proteine (NCAM, eGFP) durch Chemilumineszenz und Detektion über einen Röntgenfilm Chemilumineszenz durch POD-markierten Sekundärantikörper, der mit Chemilumineszenzlösung in Reaktion gebracht wird
• Versuchsprinzip: Röntgenfilm Die am Sekundär-AK befindliche Peroxidase wird mit Chemilumineszenz-Lösung in Reaktion gebracht Katalyse der Oxidation des enthaltenen Luminols --> Chemilumineszenz Substrat zerfällt in Grundzustand und emittiert dabei Licht Detektion des emittierten Lichts mittels Röntgenfilm Reaktion dauert je nach Chemilumineszenzlösung Sekunden bis Minuten
• Durchführung: Röntgenfilmentwicklung 1. Vorbereitung der Dunkelkammer Röntgenfilm ist lichtempfindlich --> Dunkelkammer mit Rotlicht Entwickler-, Wasser- und Fixierbad aufstellen/vorbereiten 2. Chemilunineszenzlösung Super-Signal-West Pico Kit (Luminol/Enhancer Solution + Stable Peroxid Solution) Super Signal West Dura Kit (Luminol/Enhancer Solution + Stable Peroxid Solution) --> sensitiver, aber teurer Mischung der im Kit enthaltenen Luminol-Lösung mit Peroxid-Lösung 3. Entwicklung des Röntgenfilms Fixierung einer Plastikfolie in der Autoradiographiekassette mit AK behandelte Blot-Membran zwischen die Folie legen und mit Chemilumineszenz-Lösung bedecken in der Dunkelkammer: Film auf die Folie über der Blot-Membran legen und exponieren  Film entwickeln (Entwicklerlösung - Wasser - Fixierer) und Trocknen 4. Variation der Expositionszeiten und der Chemilumineszenz-Kits falls auf dem Film nicht zu erkenen ist, kann zunächst die Expositionszeit verlängert werden und dann mit der sensitiveren Lösung gearbeitet werde
• Versuchsziel: Direct-Blue-Färbung Irreversible Anfärbung der Proteine auf der Blot-Membran zur Kontrolle des Proteintransfers beim Western-Blott im Gegensatz zur Ponceau-Färbung irreversibel sensitiver (5-10 ng Protein)
• Durchführung: Direct-Blue-Färbung 1. Blotmembran waschen Membran nach der Entwicklung erst mit dest. Wasser und dann mehrmals mit TBS/T waschen 2. Inkubation in Färbelösung Direct-blue-Färbelösung (Stammlösung + Ethanol + Essigsäure + dest. Wasser) 3. Entfernung überschüssiger Farbe mittels dest. Wasser → lila angefärbte Proteinbanden
• Molekulargewicht von a) NCAM b) eGFP c) NCAM/eGFP a) 140 kDa b) 28 kDa c) 168 kDa
• Aus wievielen Basenpaaren besteht a) pCDNA3/eGFP b) NCAM140eGFP c) pCDNA3/NCAM140 a) 6.145 b) 7.626 c) 8.008
• Was ist eGFP? Green Fluoreszenz-Protein
• Was ist GFP? Green Fluoreszenz-Protein = nicht toxisches, tonnenförmiges, fluoreszierendes Protein grüne Fluoreszenz unter UV-Licht Biolumineszenz durch Serin-, Tyrosin- und Glycinreste, deren Seitenketten miteinander reagieren und dabei fluoreszierenden Farbstoff bilden kann durch Rekombination in nicht fluoreszierende Zellen/Gewebe eingeführt werden und diese sichtbar machen nicht toxisch in Eukaryotischen Zellen wird verwendet, um biologische Prozesse in vivo zu untersuchen eGFP = enhanced Variante bei dem bestimmte AS ausgetauscht wurden (Phe ↔Leu, Ser ↔ Thr) --> geringeres Ausbleichen und stärkere Fluoreszenz
• Was ist NCAM? neurales Zelladhäsionsmolekül = Transmembranprotein
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• Möglichkeiten Zellen kompetent zu machen Behandlung mit Rubidium-Chlorid oder Calcium-Chlorid
• Unterschied DNA und RNA DNA Desoxyribose stabiler RNA Ribose Uracil statt Thymin instabiler
• Unterschied Nukleotid und Nukleosid Nukleotid = Phosphat + Zucker + Base Nukleosid = Zucker + Base --> kein Phosphat
• Was sind Primer? Wozu werden sie genutzt? einzeksträngige Oligonukleotid dient als Startpunkt für DNA-replizierende Enzyme wie die DNA-Polymerase liefern freies 3'-OH-Ende für die Polymerase Oligonukleotide (von griechisch oligo ‚wenige‘) sind aus wenigen Nukleotiden (DNA oder RNA) aufgebaute Oligomere. Die Nukleotidsequenz besteht aus 4 bis 10 Nukleotideinheiten.
• Warum wird für die PCR die TAG-Polymerase verwendet? v. a. aufgrund ihrer Hitzestabilität Temp.-Optimum: 72°C aus thermophilen Bakterien (Thermus aquaticu) isoliert
• Wie wird die TAQ-Polymerase gelagert? in Glycerin sehr empflindlich, würde sonst "kaputt gehen"
• Gesetz nach Lambert Beer und Extinktionskoeffizient von doppelsträngiger DNA A = c x E x d c = Konzentration E = Extinktionskoeffizient = 0,2 für DNA d = Schichtdicke (vernachlässigbar) A = Absorption
• Warum enthält der Resuspensionspuffer bei der Plasmidpräparation Ribonukleasen (RNAase)? Abbau von RNA in der Probe RNA würde sonst ebenfalls an Silikatsäule binden und das Ergebnis verfälschen
• Warum darf der alkalische Lysepuffer bei der Plasmidpräparation nicht länger als vorgegeben (5 min) einwirken? Membran wird sonst zu porös und chromosomale DNA würde mit austreten
• Welchen Zweck erfüllt PEQ-Green bei der Elektrophorese? interkaliert in die DNA und leuchtet unter UV-Licht grün Bestandteil des Gels lagert sich zwischen den Basen der DNA an dient der Sichtbarmachung der DNA im Gel
• Nach welchem Prinzip erfolgt die Auftrennung von DNA im Agaraosegel? Elektrophoretisch Nukleinsäuren sind bei neutralem pH polyanionisch geladen ---> wandern im elektrischen Feld auf die positiv geladene Elektrode zu. Elektrophoretische Mobilität aller Nukleinsäuren in freier Lösung gleich groß ---> Laufstrecke wird nur von Molekülgröße bestimmt Trägermaterial: Agaraosegel ---> bildet Netzwerk, in dem die DNA-Abschnitte nach Größe aufgetrennt werden größere Moleküle werden im "Agarose-Sieb" stärker zurückgehalten als kleine ---> kleiner Moleküle = längere/weitere Laufstrecke Identifizierung anhand der Laufstrecke im Gel mittels Refernzmarker
• Welchen Einlfuss hat die Agarose-Konzentration bei der Gelelektrophorese Konzentration richtet sich nach der Größe der aufzutrennenden Teilchen höher Konzentration = engerproriges Gel ---> kleinere Teilchen
• Unterschied zwischen PBS+ und PBS PBS = Phosphat gepufferte Sallösung  PBS+ = Phosphat gepufferte Sallösung mit Ca2+/Mg2+-Ionen Pufferlösung, die in der Biochemie verwendet wird. Die Lösung enthält  Natriumchlorid, Kaliumchlorid und Phosphat (in Form von HPO42− und H2PO4−). Der pH-Wert der eingestellten Pufferlösung ist 7,4. Die Eigenschaft als Pufferlösung ermöglicht das Arbeiten bei diesem konstanten pH-Wert. Durch die verschiedenen Salze besitzt die Lösung den osmotischen Druck des menschlichen Organismus
• Was ist PMSF? Wofür kann es verwendet werden? Phenylmethylsulphonylfluorid = Proteaseinhibitor → schützt Proteine vor Abbau durch Proteasen Verwendung: Zelllyse der Cos7-Zellen --> schützt die herausgelösten Zielproteine vor dem Abbau durch Proteasen
• 2 Reaktionen, die zur konzentrationsabhängigen Blaufärbung von Proteinlösungen führen 1. Biuretreaktion = Bildung eines blau-violetten, quadratisch-planaren Komplexes zwischen den Peptidbindungen und den Cu2+-Ionen in alkalischer Lösung 2. Reduktion = Cu2+ →  Cu+ ------> gelbe Folin-Reagenz → Molybdänblau -----> intensive Blaufärbung Blaufärbung wird photometrisch gemessen und auf die Proteinkonzentration
• Was ist TEMED? Wofür kann es verwendet werden? Tetramethylethylendiamin =  Polymerisationskatalysator wird daher beispielsweise zusammen mit Ammoniumpersulfat (APS) zur Polymerisation von Acrylamid bei der Anfertigung von Polyacrylamidgelen für die SDS-Page eingesetzt.
• Welche Bindungen werden bei der Denaturierung der DNA im ersten Schritt der PCR gespalten? HH-Brücken zwischen den komplementären Basenpaaren des DNA-Doppelstranges
• Welchen Einlfuss hat die Anealing Temperatur auf die Hybridisierung bei der PCR? muss spezifisch auf die Primer abgestimmt sein und ist hier abhängig von GC/AT-Verhältnis (also Sequenz des Primers) - GC-Bindung stabiler Länge des Primers zu niedrigen Temperatur → „lockeren“ unspezifischen Bindungen der Primer → unerwünschten unspezifische Produkte entstehen zu hohen Temperaturen → kein Produkt
• Was ist und enthält TBE und wofür kann es genutzt werden? TBE-Puffer = Tris-Borat-EDTA Tris-Borat = Puffersubstanz - erhält neutralen PH aufrecht EDTA = komplexiert zweiwertige Metallionen Verwendung: Herstellung von Agarosegel
• Was ist Ampicillin? Beta-Lactam-Antibiotikum Beta-Laktam-Ring Stören Synthese der bakteriellen Zellwand Resistenz: Beta-Laktamase --> spaltet Beta-Laktam-Ring
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• Was ist Kanamycin? Überbegriff für eine Reihe antibiotisch wirkender Substanzen - Selektionsantibiotika (= Verwendung um eine gentechnisch hervorgerufene Antibiotikaresistenz zu beurteilen) Wirkweise: fehlerhafte Proteinsynthese (Translation) Resistenz = Synthese von Enzymen die das Antibiotikum inaktivieren
• Unter welchen Bedingungen lagert sich Plasmid-DNA an Silikate an? leicht saure pH-Werte
• Welchen Zweck erfüllen der Transferpuffer und Methanol beim Western Blot? Transferpuffer = Glycin + Tris + SDS Proteine lösen sich im Puffer und fließen in dessen Strom passiv mit, bis sie von der Membran festgehalten werden. Methanol  erleichtert das Benetzen der Membran und lockert Bindung der Proteine an das SDS-Gel
• Durch welche Art von Wechselwirkungen werden die Proteine beim Western-Blot an die Membran gebunden? hydrophobe oder ionische Wechselwirkungen je nach Art der Membran
• Mittel um Zellen/Bakterien kompetent zu machen Rubidiumchlorid Calcium-Chlorid
• Inhaltsstoffe der Coomassie-Färbelösung Essigsäure + Ethanol + Coomassie-Farbstoff (= Triphenylmethanfarbstoff) Farbstoff bindet nur unter sauren Bedingungen an die basischen AS ---> Anfärbung SDS-Gel
• An welchen Bereich der Proteine lagert dich der Triphenylmethanfarbstoff Coomassie an? basische Seitenketten der AS ---> färbt deshalb Proteine mit vielen basischen AS stärker an (Lysin, Arginin)
• Eine sensitivere Methode zum Anfärben von SDS-Gelen als Coomassie Silberfärbung - höher Empfindlichkeit - zeit- und arbeitsaufwendiger
• Inhaltsstoffe der Ponceau-Färbelösung Ponceau S + Essigsäure ---> saures Milieu Entfärbung durch Erhöhung des pH-Wertes mittels PBS
• Warum werden die Cos7-Zellen vor der Trypsinierung mit HBSS gewaschen? Entfernung zweiwertiger Kationen, die die Zelladhäsion fördern und überschüssiger Proteine zur Erleichterung der Trypsinierung
• Bei welchen Wellenlängen wird die Proteinkonzentration im Zelllysat nach Lowry bestimmt? 540 nm 650 nm 750 nm
• Absorptionsmaximum von a) Nukleinsäuren b) Proteinen a) 260 nm b) 280 nm ---> Reinheitsgrad: A 260 nm / A 280 nm = 1,8 - 2 (gut) Photometrische Konzentrationsbestimmung nach Plasmidpräparation
• Welche der verwendeten Plasmide besitzen ein Reistenzgen gegen Ampicillin und welche gegen Kanamycin pCDNA3/NCAM140 - Ampicillin (NCAM-Plasmid) pCDNA3/eGFP - Ampicillin (eGFP-Plasmid) NCAM140eGFP - Kanamycin (NCAM-eGFP-Plasmid)
• Sinn des Sammelgels bei der SDS-Page. Welchen Zweck erfüllen hierbei Glycin und Chlorid-Ionen? Aufkonzentrierung der Proben an einer Startlinie vor der Auftrennung im Trenngel ---> schärfere Banden Chlorid = Leition --> negativ geladen ---> wandert schnell in Richtung Anode Glycin = Folgeion --> im Sammelgel als Zwitterion ---> wandert sehr langsam Proteine wandern dazwischen zwischen dem Leit- und dem Folgeion (wo die Proteine sich befinden) baut sich ein Spannungsgradient auf, wodurch dort eine höhere Feldstärke wirksam ist langsam laufende Proteine werden beschleunigt bis sie an Trennlinie (kurz vor Chlorid-Ionen) ankommen. schnell laufende Proteine werden kurz vor den Leitionen durch die negative Ladung abgebremst ⇒ alle Proteine kommen gemeinsam an der Grenze zum Trenngel an und werden dort konzentriert

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