144

Biochemie ELW (Subject) / Laborpraktikum Biochemie (Lesson)

This lesson was created by S7stkoch.

Learn lesson

This lesson is not released for learning.

back  |  next 2 / 3

• Richtig oder Falsch? eGFP ist ein cytosolisches Protein Richtig
• Erklärung dafür, dass die Transfektionseffizienz bei eGFP größer/besser ist als bei NCAM/eGFP Fusionsprotein NCAM/eGFP ist größer als eGFP --> geringere Translationsrate NCAM/eGFP-Plasmide sind größer und gelangen somit schwerer durch die Zellmembran --> geringere Transfektion
• Materialien/Stoffe, die für die Hoechstfärbung benötigt werden und ihre Funktion Transfizierte Zellen mit guter Konfluenz (50-70%) Hoechst-Stammlösung = Farbstoff zum Einfärben der Zellkerne PBS+ = Phosphat gepufferte Sallösung mit Ca2+/Mg2+-Ionen Ca2+/Mg2+-Ionen unterstützden die Zelladhäsion --> Zellen sollen in diesem Fall nicht von Kulturgefäß gelöst werden Waschen --> Entfernung von Medium Formaldehydlösung --> Fixierung der Zellen und macht Zellmembran permeabel enthält Methanol --> macht Zellmembran permeabel genaue Einhaltung der Fixierzeit, weilo sonst Membran zu löchrig wird und eGFP aus dem Cytosol austritt Fluoreszenz-Mikroskop
• Versuchsziel: Zelllyse (Proteinbiochemie) Lyse der transfizierten Cos-7-Zellen, um die aufgrund der transfizierten DNA gebildeten Proteine freizusetzen/verfügbar zu machen
• Versuchsprinzip: Zelllyse Cos-7-Zellen (Proteinbiochemie) Lyse = aktives Aufbrechen der Zellen von Gewebe oder Zellkulturen um DNA oder Proteine freizusetzen mechanisch durch Ultraschall  chemische Mittel (Ripa-Lysepuffer) --> Zerstörung der Zellmembran
• Materialien/Stoffe die für die Zelllyse der Cos-7-Zellen benötigt werden und ihre Funktion Transfizierte Zellen RIPA-Lysepuffer (RadioImmunoPrecipitation Assay) enthält Detergenz, das die Zellmembran zerstört und NCAM aus der Membran herauslöst wird 1:100 mit PMSF verdünnt PMSF (PhenylMethylSulphonyFluorid) Proteaseinhibitor --> schützt Zielproteine nach dem Herauslösen aus der Membran vor dem Abbau PBS --> Waschen um Medium zu entfernen Zellschaber --> lösen der Zellen von der Schale Eis --> Inkubation auf Eis + vortexen um Zelllyse zu unterstützen Zentrifuge --> Zelltrümmer sedimentieren, Proteine bleiben in Lösung
• Durchführung Zelllyse transfizierter Cos-7-Zellen 1. Verdünnung der RIPA-Lysepuffers mit PMSF RIPA-Lysepuffer enthält Detergenz, das die Zellmembran zerstört und NCAM aus Membran löst PMSF = Proteaseinhibitor --> schützt die Zielproteine nach dem Herauslösen vor Abbau 2. Zelllyse Transfizierte Zellen auf Eis platzieren um Zellstoffwechsel und Enzyme zu stoppen verbrauchtes Medium absaugen und mit PBS waschen RIPA-Lysepuffer auf die Zellen geben und Zellen mittels Schaber von Schale lösen Zellsuspension auf Eis inkubieren und zwischendurch vortexen um Zelllyse zu unterstützen Zentrifugation --> Zelltrümmer setzen sich ab, Proteine bleiben in Lösung Überstand aufbewahren
• Versuchsziel: Proteinkonzentrationsbestimmung im Zelllysat (nach Lowry) Bestimmung der Proteinkonzentration im durch Zelllyse der transfizierten Zellen erhaltenen Zelllysats, um festzustellen wieviel μl des Lysats 30 μg Protein enthalten, weil für die SDS-Page genau 30  μg Protein verwendet werden sollten
• Versuchsprinzip: Proteinkonzentrationsbestimmung im Zelllysat nach Lowry Proteinkonzentration wird in proportion zur Farbveränderung der Probelösung angezeigt, die mittels kolorimetrischer Techniken gemessen werden kann.  2 Reaktionsschritte: 1. Biuretreaktion = Bildung eines blau-violetten, quadratisch-planaren Komplexes zwischen den Peptidbindungen und den Cu2+-Ionen in alkalischer Lösung 2. Reduktion = Cu2+ wird zu Cu+ reduziert und dieses wiederum reduziert das gelbe Folin-Reagenz zu Molybdänblau --> intensive Blaufärbung Blaufärbung wird photometrisch gemessen und auf die Proteinkonzentration zurückgeschlossen durch Vergleich mit einer Standardreihe aus BSA (Rinder-Serum-ASlbumin)
• Durchführung: Proteinkonzentrationsbestimmung im Zelllysat (nach Lowry) 1. Herstellung einer Standard-Verdünnungsreihe 10 Eppendorfgefäße mit mit RIPA-Lysepuffer und BSA-Lösung (Rinder-Serum-Albumin) 2. Dreifachbestimmung auf einer Mikrotiterplatte Standards und Probe in vertiefungen der Mikrotiterplatte pipettieren Reagenz S und Reagenz A (= alkalische Kupfer-Tartrat-Lösung) des DC-Protein-Assays mischen und in die Vertiefungen pipettieren --> liefert alkalischen pH und Cu2+-Ionen für die Biuretreaktion Reagenz B (Folinreagenz) hinzufügen ---> Reduktion von Cu2+ zu Cu+, das wiederum das gelbe Folin-Reagenz zu Molybdänblau reduziert ---> Blaufärbung (unterschiedlich intensiv, je nach Proteinkonzentration  3. Absorptionsmessung im ELISA Reader 690 nm 4. Auswertung der der Daten mittels GraphPad Prism Standardgerade/Kalibriergerade anhand der Standard-Verdünnungsreihe
• Advertisement
• Materialien/Stoffe die für die Proteinkonzentrationsbestimmung im Zelllysat nach Lowry benötigt werden und ihre Funktion Zelllysat RIPA-Lyse-Puffer + BSA-Lösung (Rinder-Serum-Albumin) Herstellen von Standards für die Standard-Verdünnungsreihe BSA = Protein RIPA-Lysepuffer = Medium DC-Protein-Assay (Reagenz A + B + S) Reagenz A = Alkalische Kupfer-Tartrat-Lösung --> liefer Cu2+ und sorgt für alkalischen pH-Wert für die Biuretreaktion* Reagenz B = Folinreagenz --> wird zu Molybdänblau reduziert und ist verantwortlich für die Farbreaktion, die je nach Proteinkonzentration unterschiedlich stark ausfällt Mikrotiterplatte einpipettieren der Standards und der Proben und Messung im ELISA ELISA-Reader Absorptionsmessung bei 690 nm  Absorption proportional zur Proteinkonzentration GraphPad Prism (Computerprogramm) berechnet Kalibriergerade und anhand dessen direkt die Proteinkonzentration in der Probe *Biuretreaktion  = Bildung eines blau-violetten-quadratisch-planaren Komplexes zwischen den Peptidbindungen und den Cu2+-Ionen in alk. Lösung
• Versuchsziel: SDS-Page Auftrennung der im Zelllysat enthaltenen und durch Zelllyse isolierten Proteine/Polypeptide nach ihrem Molekulargewicht mittels ihrer Ladung in einem elektrischen Feld durch ein Polyacrylamid-Gel
• Was ist SDS-Page? Sodiumdodecyl (SDS)-Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE) elektrophoretische Methode um Polypeptide enstprechend ihres Molekulargewichts aufzutrennen wird in Polyacrylamid-Gelen die Sodiumdodecylsulfat (SDS) enthalten durchgeführt
• Was ist SDS Sodiumdodecylsulfat anionisches Detergenz bildet Mizellen in wässriger Lösung bindet an hydrophobe Regionen von Proteinen, wodurch diese in ihre Untereinheiten dissoziieren durch Bindung erhalten Proteine negative Ladung, die Eigenladung wird überdeckt Proteine binden SDS zu negativ geladenen SDS-Protein-Komplexen mit einem konstanten Ladungs-Masse-Verhältnis denaturiert Proteine und unterbindet Protein-Protein-WW
• Welchen zweck erfüllt ß-Mercaptoethanol bei der SDS-Page? zusätzliches* Aufbrechen der SS-Brücken der Proteine * zusätzlich zur Denaturierung und Überlagerung der Eigenladung der Proteine durch SDS slebst → wenn Proteine mit SDS und ß-Mercaptoethanol behandelt werden, beruht die elektrophoretische Trennung im Polyacrylamidgel weitgehen nur noch auf dem Molekulargewicht und damit auf der Größe der Proteine bzw. der SDS-Protein-Komplexe
• Welche Bedingungen muss die Trennmatrix bei einer SDS-Page erfüllen? Durchmischung herabsetzten darf nicht mit Proteinen interagieren und dadurch die Beweglichkeit behindern Acrylamid, N,N-Methylenbisacrylamid und TEMED in polymerisieter Form erfüllen diese Kriterien
• Welchen Zweck erfüllt Ammoniumperoxodisulfat (APS) bei der SDS-PAGE? Polymerisationsstarter bildet in Wasser freie Radikale, die das Acrylamid aktivieren aktiviertes Acryamid reagiert unter Bildung von langen Ketten mit viskosem Charakter weiter Quervernetzung durch N,N-Methylenbisacrylamid führt zur Gelbildung
• Welchen Zweck erfüllt N,N-Mehylenbisacrylamid bei der SDS-PAGE Quervernetzung mit Acrylamid --> Gelbildung
• Wozu dient der Puffer in der SDS-PAGE und welche Voraussetzungen muss er erfüllen? Aufrechterhaltung des pH-Wertes innerhalb des Gels Elektrolyt für die Stromleitung innerhalb des elektrischen Feldes im Gel darf keine WW mit Proteinen eingehen muss richtige Ionenstärke haben, weil diese Einlfuss auf die Wandereigenschaften und die Trennschärfe hat bei geringer Konzentration leiten Proteine den Strom sleber weiter, was wiederum die Trennschärfe in Form diffuser Trennzonen beeinflusst zu hohe Elektrolytkonzentration führt zu Zunahme der Stromstärke bei gleichzeitiger Vermidnerung der Spannung ---> Verlangsamung der Wanderung ---> verstärkte Wärmebildung --> Proteindenaturierung
• Merkmal(e) der diskontinuierlichen SDS-PAGE 2 verschiedene Gele, die sich durch Porengröße und pH-Wert unterscheiden 1. Sammelgel oben weite Poren pH-Wert: 6,8 dient der Fokussierung der Proben an der Grenze zum (unteren) Trenngel = Startlinie 2. Trenngel unten engere Poren höherer pH-Wert von 8,8 dient der Auftrennung der Proteine
• Welchen Zweck erfüllen die Chlorid- und Glycin-Ionen im Puffer (Tris-HCl) bei der SDS-PAGE Chlorid-Ionen = Leit-Ionen im Sammelgel bewegen sich im Sammelgel schneller als Glycin-Ionen (Folge-Ionen) es kommt zu einem Mangel an Ladungsträgern und einer Zone hoher elektrischer Feldstärke → SDS-Protein-Komplexe lagern sich zwischen Leit- und Folge-Ionen an und wandern Richtung Trenngelfront → Aufkonzentrierungdre Proben Glycin-Ionen  liegen bei pH 6,8 im Sammelgel als Zwitterionen vor beim Übergang in das Trenngel erhalten sie negative Netto-Ladung durch den abrupten pH-Wert-Anstieg auf 8,8 --> Überholen  Makromoleküle Mangel an Ladungsträgern ist aufgehoben und Proteine befinden sich in homogenen Puffer --> Proteinstapel löst sich auf
• Anhand von welchem Parameter werden Proteine in der SDS-Page identifiziert? apparentes Molekulargewicht bzw. Größe kann mittels Standards bestimmt werden
• Von welchen Faktoren wird die Wanderungsgeschwindigekeit eines Proteins im elektrischen Feld beeinflusst? Welcher Faktor ist für die SDS-PAGE entscheidend? Größe! Form wird durch SDS und Mercaptoethanol vereinheitlicht Ladung wird durch SDS überdeckt → Auftrennung bei SDS-PAGE nur noch nach Größe bzw. Molekulargewicht
• Richtig oder Falsch? Acrylamid bildet zusammen mit Bisacrylamid ein quervernetztes Netzwerk, wenn ein Radikalstarter zugesetzt wird Richtig Radikalstarter = APS oder TEMED
• Warum wurde im Praktikum bei der SDS-PAGE ein 6%iges und ein 12%iges Trenngel verwendet? Aufgrund der unterschiedlichen Molekülmassen der Zielproteine 6%iges Gel = größere Poren --> Auftrennung von NCAM (140 kDa) und NCAM7eGFP (168 kDa) 12%iges Gel = engere Poren --> Auftrennung von eGFP (28 kDa)
• Warum wurde im Praktikum bei der SDS-PAGE TEMED erst kurz vor dem Gießen der Gele hinzugefügt? TEMED startet die Polymerisierung, also damit es sich nicht zuvor schon verfestigt
• Materialien/Stoffe die benötigt werden, um das Gel für die SDS-PAGE herzustellen und ihr Sinn Acrylamid-Lösung (Acrylamid + Bisacrylamid) wird in Gegenwart von freien Radikalen aktiviert und polymerisiert zu langen Ketten APS und TEMED starten die chemische Polymerisierung durch Radikalbildung Tris-HCL pH 6,8 und Tris-HCl pH 8,8 pH-Werte für das Sammelgel (6,8) und das Trenngel (8,8) erhalten SDS Dissoziiert Proteine in ihre Untereinheiten bindet an Proteine und überdeckt ihre Eigenladung Entstehung von negativ geladenen SDS-Protein-Komplexen mit konstantem Ladung-zu-Masse-Verhältnis Dest. Wasser
• Materialien/Stoffe um die Proben für die SDS-Page vorzubereiten und ihr Sinn Zelllysat mit definierter Menga an Protein (30 μg) Probenpuffer (Tris, SDS, Mercaptoethanol, Glycerin, Bromphenolblau) Anfärbung. der Laufmittelfront mit Bromphenolblau Glycerin verdichtet Probe, sodass diese in die Taschen sinkt Mercaptoethanol --> Trennung von SS-Brücken SDS --> Überlagerung der Eigenladung der Proteine und Komplexbildung Tris enthält Chlorid und Glycin ---> Aufkonzentrierung der Proben im Sammelgel Zentrifuge + Vortexer + Heizblock vortexen und erhitzen auf 95°C und kurz anzentrifugieren --> Denaturierung der Proteine und Spaltung der H-Brücken
• Inhaltsstoffe der Probenpuffers bei der SDS-PAGE Tris-HCl Puffer ---> sorgt für richtigen pH-Wert enthält Chlorid (Leit-Ionen) und Glycin (Folge-Ionen) --> Aufkonzentrierung der Proteine im Sammelgel SDS überdeckt die Eigenladung der Proteine und bildet negativ geladene Komplexe mit ihnen, sodass die Auftrennung nach Größe erfolgen kann Mercaptoethanol löst die S-S-Brücken in den Proteinen Glycerin verdichtet die Probe damit diese in die Taschen absinkt Bromphenolblau Anfärben der Laufmittelfront, damit man sehen kann, wann der Lauf beendet werden muss
• Nenne eine Möglichkeit ein Gel nach der SDS-PAGE einzufärben Coomassie-Färbung irreversibel mäßige Empfindlichkeit (300-1000 ng Protein/Bande) --> nicht für geringe Proteinkonzentrationen färbt Polypeptide mit vielen basischen Resten (Lys, Arg) verstärkt an
• Advertisement
• Versuchsziel: Coomassie-Färbung Anfärben und damit Sichtbarmachung der Proteinbanden auf dem SDS-Gel um überprüfen zu können, ob die Auftrennung mittels SDS-Page funktioniert hat und die zuvor durchgeführte Konzentrationsbestimmung des Zelllysats (Punkt 2.2) genau war und somit vergleichbare Proteinmengen auf das Gel aufgetragen wurden.
• Versuchsprinzip: Coomassie-Färbung Coomassie-Brillant-Blau = Triphenylmethanfarbstoff lagert sich an basische Seitenketten von AS an --> Anfärbung von Proteinen benötigt saures Milieu --> Gel muss nach Lauf in Essigsäure/Ethanolsäure fixiert werden Überschüssige Farbe wird mit Entfärbelösung weggewaschen bis Hintergrund klar ist Dauer: 2-3 h irreversible Färbung mäßige Empfindlichkeit 
• Durchführung: Coomassie-Färbung 1. Anfärben der Proteinbanden SDS-Gel wird in Coomassie-Färbelösung (Essigsäure + Ethanol + Coomassie-Farbstoff) gelegt und unter Schütteln inkubiert 2. Abgießen der Färbelösung und Auswaschen überschüssiger Farbe Entfärbelösung hinzugeben und inkubieren Schritt so oft wiederholen, bis Proteinbanden deutlich erkennbar und Hintergrund klar
• Können mittels der Coomassie-Färbung bestimmte Proteine identifiziert werden? Nein, dazu ist eine spezifische Methode wie die Behandlung mit Antikörpern nötig Es werden alle enthaltenen Proteine aufgetrennt nach Größe sichtbar gemacht
• Versuchsziel: Western Blot Übertragung der Proteine aus dem SDS-Gel auf eine Membran aus Nitrocellulose um sie für die Anbtikörper der späteren Antikörperbehandlung zugägnlich zu machen
• Versuchsprinzip: Western-Blot Elektrophoretische Übertragung der Proteine aus dem SDS-Gel auf eine Nitrocellulosemembran Anlegen eines elektrischen Feldes --> negativ geladene Proteine wandern aus dem Gel heraus auf Plus-Pol zu zwischen Gel und Plus-Pol befindet sich die Membran --> Membranen binden Proteine durch hydrophobe WW gebundene Proteine sind für makromolekulare Linganden (z.B. AK) frei zugänglich
• Aufbau des Semi-dry Western-Blot Kathode (-) 3 Lagen in Puffer getränktes Filterpapier  SDS-Gel Blot-Membran 3 Lagen in Puffer getränktes Filterpapier Anode (+)
• Aus welchem Grund werden SDS-Gel, Blot-Memran und Filterpapier beim Western-Blot in ein Gemisch aus Puffer und methanol getränkt? Transferpuffer (Glycin, Tris, SDS) + Methanol Proteine lösen sich im Puffer und fließen in dessen Strom passiv mit, bis sie von der Membran festgehalten werden. Methanol aktiviert die Membran --> erleichter das Benetzen der Membran und lockert die Bindung der Proteine an SDS-Gel Glycin dient durch seine Ladung (-) als Laufmittel Tris zur pH-Wert-Stabilisierung
• Durchführung: Western Blot 1. Ansetzen des Transferpuffer Wasser + Transferpuffer-Stammlösung (Tris + Glycin) + Methanol 2. Inkubation der Gele, Membranen und Filterpapiere im Transferpuffer 3. Zusammenbau der Blotkammer und Spannung anlegen Kathode (-) - Filterpapiere - SDS-Gel - Membran - Filterpapiere - Anode (+) Entfernung von Luftblasen und überschüssigem Puffer mittels einer Rolle/Walze Spannung anlegen ( 11 mA /cm2 Gel) 4. Membran entfernen und Gel + Filterpapiere verwerfen keine Proteine mehr im Gel
• Möglichkeiten eine Blot-Membran einzufärben Ponceau-Färbung reversibel Direct Blue irreversibel
• Versuchsziel: Ponceau-Färbung Reversible Anfärbung der Proteine auf der Blot-Membran zur Kontrolle des Proteintranfers beim Western-Blot und um Proetinbanden des Markers einzeichnen/markieren zu können
• Versuchsprinzip: Ponceau-Färbung Ponceau S = Azofarbstoff , der leicht mit Wasser auszuwaschen ist Färbung ist reversibel und nicht sehr sensitiv Membranen können danach weiterverwendet werden --> AK-Behandlung
• Versuchsdurchführung: Ponceau-Färbung 1. Anfärben und Markierung der Marker-Banden Ponceau-Färbelösung (Ponceau S + Essigsäure) auf die Membran geben Inkubation unter Schwenken Färbelösung zurück in die Flasche (kann wiederverwendet werden) und waschen mit destilliertem Wasser bis Hintergrund klar ist ---> rosa Proteinbanden erkennbar Nachzeichnen der Markerbanden mit Bleistift 2. Entfärbung zur Weiterverwendung der Membran Membran in PBS tränken (pH ↑) --> Farbstoff von den Proteinen wird entfernt und Antigen wird leichter zugänglich für Antikörper
• Versuchsziel: Antikörperbehandlung der Blot-Membran Spezifischer Nachweis der gebloteten Antigene/Proteine (NCAM und eGFP) mittels spezifischer Antikörper NCAM Primärantikörper: 123C3 Sekundärantikörper: anti-Maus-IgG-POD eGFP Primärantikörper: eGFP-spezifischer AK Sekundärantikörper: anti-Kaninchen-IgG-POD
• Versuchsprinzip: Antikörperbehandlung der Blot-Membran Geblottete Antigene lassen sich mit Antikörpern spezifisch nachweisen 1. Freie Antigenbindungsstellen auf der Membran mit einem Blocker (Milchpulver) absättigen 2. Inkubation der blockierten Blot-Membran mit einem Primärantikörper Primärantikörper = Antigen-spezifischer-AK ---> bindet spezifisch ans Antigen (NCAM/eGFP) 3. Inkubation der blockierten und mit Primärantikörpern versehenen Blot-Membran mit einem POD-markierten* Sekundärantikörper Sekundärantikörper = bindet spezifisch an Primärantikörper können aufgrund ihrer POD-Markierung mittels Chemilumineszenz sichtbar gemacht werden *POD = Peroxidase
• Erkläre, wie durch Chemilumineszenz POD-markierte Sekundärantikörper sichtbar gemacht werden können POD-markierter Sekundärantikörper bindet an Primärantikörper Peroxidase wird mit einem Signalreagenz (Chemilumineszenzlösung) in Reaktion gebracht und katalysiert hierbei die Oxidation und Anregung von Luminol. Chemiluminszenz --> Wenn das angeregte Substrat in seinen Grundzustand zerfällt emittiert es Licht Detektion --> emittiertes Lich kann mittels Röntgenfiln detektiert und sichtbar gemacht werden
• Durchführung: Antikörperbehandlung der Blot-Membran 1. Blockierung Inkubation der Blut-Membran in Milchpulverlösung ---> freie Bindungsstellen auf der Membran werden besetzt Waschen der Membran mit TBS/T (Tris, NaCl, pH 7,6, Tween) ---> Herabsetzen der Oberflächenspannung und Minderung unspezifischer WW durch enthaltene Tenside (Tween-20) --> Signale werden spezifischer 2. Primärantikörper Primärantikörper mit Milchpulverlösung verdünnen und auf die Membran auftragen --> spezifische Bindung an die Antigene NCAM: 123C3 eGFP: eGFP-spezifischer-AK Inkubation auf Wippe über Nacht Waschen mit TBS/T 3. Sekundärantikörper Sekundärantikörper mit Milchpulverlösung verdünnen und auf die Membran geben NCAM: anti-Maus-IgG-POD eGFP: anti-Kaninchen-IgG-POD Inkubation auf Wippe (90 min, RT) Waschen mit TBS/T Waschen mit TBS --> um Tween zu entfernen, weil dies sonst bei der Entwicklung des Röntgenfilms stören könnte ---> Sichtbarmachung durch Röntgenfilm
• Welcher Puffer wird zum waschen der Blot-Membran bei der Antikörperbehandlung verwendet? TBS/T (Tris, NaCl, Tween 20)  Tris = Puffersubstanz --> pH 7,6 NaCl --> physiologische Salskonzentration bzw. Ionenstärke Tween-20 = Tenside --> mindern unspezifische WW7 nach auftragen des Sekundärantikörpers muss danach zusätzlich mit TBS (OHNE TWEEN) gewaschen werden, weil Tween die Röntgenbildentwicklung stören würde Tris-Buffered-Salin + Tween
• Primär- und Sekundärantikörper von NCAM bei der AK-Behandlung Primär-AK: 123C3 Sekundär-AK: anti-Maus-IgG POD
• Primär- und Sekundärantikörper von eGFP bei der AK-Behandlung Primär-AK: eGFP-spezifischer AK Sekundär-AK: anti-Kaninchen-IgG POD

back  |  next 2 / 3