Mikrobiologie (Subject) / Bak. Aufbau/Wachstum (Lesson)

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• Nährmedien - Extrakte Unter Erhitzung gewonnene wässrige Auszüge, zu Pulver eingedampft Fleischextrakt - aus enzymatisch verdautem fettfreiem Fleisch  Hefeextrakt - aus autolysierter Bierhefe  Malzextrakt - aus Gerstenmalz
• Nährmedien - Peptone (Polypeptide) enthalten v.a. Eiweißspaltprodukte,die durch Behandlung pfl. oder tier. Eiweiße mit Enzymen hergestellt wurden. Aus Casein (Proteingemisch der Milch):durch Aufschluss von Casein durch Trypsin Aus Sojabohnenmehl: papainisch verdaut Aus Fleisch:– Tryptisch verdaut– Peptisch verdaut
• Substanzen für synthetische Nährmedien • C-Quelle: z.B. Glucose oder Acetat• N-Quelle: Ammoniumsalze• S-Quelle: H²S, Cystein,• Anorg. Salze, Wachstumsfaktoren (AS, Vitamine)
• Gelatine (15% - Lösung) Aus Knochen (Strukturproteine und Collagen)  Schmelzen: 20 – 25°C Festwerden: 20°C Sterilisation: strömender Dampf (100°C) Anwendung: Fast ausschließlich zum Nachweis von proteolytischen Enzymen („Gelatineverflüssigung“)
• Sterile Kartonscheiben Umgehung des Verfestigungsmittels durch Tränken einer sterilen Kartonscheibe mit dem Kulturmedium
• Komplettnährmedien Beispiele 1. Standard-I-Agar (für Bakterien)2. Tomatensaft-Agar (für Milchsäurebakterien)3. Malzextrakt-Agar (für Hefen, Pilze)4. Hefeextrakt-Agar (für Hefen, Pilze)
• Wachstumsparameter - Temperatur Erhöhung der Temperatur -> chem. / enzym. Reaktionen beschleunigt -> zu hohe Temperatur: Zerstörung von Membranen, Proteinen -> Zelltod Minimale Wachstumstemperatur: unterhalb derer ist Wachstum nicht möglich Optimale Wachstumstemperatur: gutes Zellwachstum Maximale Wachstumstemperatur: Überschreitung -> Tod Allgemeine Temperaturspanne: -15°C bis 115°Co kryophil: min. 0°, opt. 15°, max. 20° -> marineo psychrotolerant: min. 3-5°o mesophil: max. 20-42°o thermophil: opt. > 40°, max. 70°1o extrem thermophil: opt. > 65°, max. 70-80°o hyperthermophil: opt. > 80-90° enger Temperaturbereich: stenothermal / weiter Temperaturbereich: eurythermal
• Wachstumsparameter - pH-Wert o acidophil: opt. pH < 4o neutrophil: opt. pH 6-7o alkaliphil: opt. pH > 8 Natürliche Habitate bei 5-9
• Wachstumsparameter - osmotischer Wert: Aufrechterhaltung der Körperform -> treibende Kraft bei Zellteilung; Stabile Zellwand Osmotisches Gleichgewicht essentiell für Aufrechterhaltung bei Regen, Austrocknungo halophil: Organismen, die best. höhere Salzkonzentration benötigeno halotolerant: kurze Zeit Erhöhung der Salzkonzentrationo osmophil: zuckerhaltige Habitateo Xerophil: extrem trockenes Millieu
• obligat aerob Wachstum in der Zone, in der Luftsauerstoff in den Nährboden eindiffundiert,sie wachsen nicht im Bereich ohne Sauerstoff (obligat = streng, aer = Luft). Obligat aerobeMikroorganismen gewinnen Energie durch Atmung.
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• mikroaerophil Sonderfall aerober Mikroorganismen. Wachstum besser mit verringertemSauerstoff-Gehalt möglich. Energiegewinnung durch Atmung.
• obligat anaerob kein Wachstum im Bereich mit Luftsauerstoff im Nährboden. Sauerstoffwirkt hemmend, daher Wachstum im Bereich ohne Sauerstoff. (an = ohne) Obligat anaerobe Mikroorganismen gewinnen Energie durch Gärung.
• fakultativ anaerob Wachstum ohne und mit Luftsauerstoff möglich. Indifferente =Luftsauerstoff hemmt nicht, Opportunisten = Luftsauerstoff wird mitverwendet (fakultativ,Abkürzung fakt. = wahlweise). Fakultativ anaerobe Mikroorganismen atmen oder gären.
• Autotrophe Mikroorganismen Sie sind im allgemeinen nicht in der Lage organische Substanzen zu verwerten. Einfache anorganische Stoffe dienen zum Aufbau ihrer Zellwandbestandteile und als C-Quelle nutzen sie Kohlendioxid.  Photoautotrophe M. nutzen die Lichtenergie mit Hilfe von Assimilationsfarbstoffen  Chemoautotrophe M. nutzen die Energie durch Oxidation anorganischer Substanzen
• Heterotrophe Mikroorganismen Sie verwerten als C-Quelle nicht nur CO2 sondern benötigen auch noch eine andere C-Quelle. Zur Entwicklung brauchen sie zusätzlich mineralische Stoffe und andere komplexe organische Verbindungen (Proteine...). Die lebensnotwendige Energie gewinnen die heterotrophen Mikroorganismen ausschließlich aus organischen Substanzen, insbesondere durch Oxidation von Kohlenhydraten oder anderen energiereichen organischen Verbindungen. Für die Lebensmittelindustrie haben besonders die heterotrophen Mikroorganismen erhebliche Bedeutung.  Saprophyten, Nahrung von toten Substanzen  Parasiten, Nährstoffe von lebenden Geweben
• Nährstoffbedarf - Wasser Der Wassergehalt eines Mikroorganismus beträgt 70-98 %. Er ist damit der Hauptbestandteil der lebenden Zelle. Wasser ist an fast allen Prozessen der Stoffaufnahme beteiligt. Bei einigen Mikroorganismen wird Wasser direkt über die Photosynthese zur Energiegewinnung benötigt.  Die lebenserhaltende Funktion des Wassers nutzt man in umgekehrter Richtung zur Konservierung von Lebensmitteln. Durch den Wasserentzug wird Wachstum und der Stoffwechsel der Mikroorganismen verhindert.
• Nährstoffbedarf - Kohlenstoff Bedarf an Kohlenstoff richtet sich danach, ob es sich um heterotrophe oder autotrophe Mikroorganismen handelt und nach der Art des Mikroorganismus Während Hefen z.B. Glucose als Kohlenstoffquelle genügt, benötigen andere Mikroorganismen, wie z.B. Propionibacterium spp. komplizierte organische Verbindungen.  Im allgemeinen wachsen Bakterien bevorzugt auf eiweißreichen Medien und Fungi bevorzugt auf zuckerhaltigen Medien.
• Nährstoffbedarf - Stickstoff Mehrzahl der MO benötigen organische oder anorganische Stickstoffverbindungen Bodenbakterien der Gattung Rhizobium in Symbiose mit Leguminosen und Bodenbakterien der Gattung Acetobacter sind in der lage Luftstickstoff zu verwerten Stickstoffquelle: NH4+ (wird durch Aminierung der Ketosäuren in Asparagin- und Glutaminsäure überführt), Ammoniak, Harnstoff, Fette, Phenole
• Mineralstoffe - Phosphor Bestandteil der Nucleinsäuren, wirkt bei der Energieübertragung z.B. in Form von Adenosintriphosphat (ATP) mit, ist am Aufbau der Zellmembran in Form von Phospholipiden beteiligt ist Bestandteil bei einigen Enzymen.
• Mineralstoffe - Schwefel wird für die Proteinsynthese benötigt. Bestandteil der prosthetischen Gruppen einiger Enzyme und des Coenzyms A. Bei den meisten Mikroorganismen wird der Phosphor und der Schwefel aus organischen Verbindungen gewonnen.
• Mineralstoffe - Kalium, Calcium, Magensium & Natrium Calcium wird z.B. zur Sporenbildung benötigt. Kalium ist bei nahezu allen Zellen an der Regulation des Wasserhaushaltes beteiligt. Darüber hinaus hat Kalium stoffwechselregulatorische Aufgaben. Magnesium ist für die Aktivierung von Enzymen und für die Stabilisierung von Nucleinsäuren und Ribosomen erforderlich.
• Suppline (Wachstumsfaktoren) spezielle organische Verbindungen, die für die Entwicklung der Zelle essentiell sind, da sie nicht synthetisiert werden können.  Man unterscheidet drei Stoffgruppen: Vitamine, Aminosäuren und Pyrimidine bzw. Purine
• Suppline (Wachstumsfaktoren) spezielle organische Verbindungen, die für die Entwicklung der Zelle essentiell sind, da sie nicht synthetisiert werden können.  Man unterscheidet drei Stoffgruppen: Vitamine, Aminosäuren und Pyrimidine bzw. Purine
• Vitamine Viele Vitamine sind unerläßliche Wachstumsfaktoren für die Mikroorganismenzelle. vitaminheterotrophe und vitaminautotrophe Mikroorganismen, so daß im einzelnen zu prüfen ist, ob und in welcher Art Vitamine zugeführt werden müssen. Häufig ist festzustellen, daß bei Anwesenheit von bestimmten Vitaminen im Medium ein deutlich verbessertes Wachstum zu verzeichnen ist. Die mikrobiologisch wichtigsten Vitamine sind Thiamin (Vitamin B1), Riboflavin (Vitamin B2), Pyridoxin (Vitamin B6), Biotin (Vitamin H), Pantothensäure, Folsäure und Cobalamin (Vitamin B12)
• Aminosäuren als Bestandteile der Proteine, können nur teilweise von der Zelle synthetisiertwerden. Einige essentielle Aminosäuren müssen deshalb über das Nährmedium zugeführt werden. = (auxotroph)
• Pyrimidine & Purine Pyrimidine (Uracil, Thymin und Cytosin) und Purine (Adenin und Guanin) werden in der Zelle zur Synthese der Nucleinsäuren benötigt.
• Vermehrung der Bakterien vermehren sich ungeschlechtlich durch Querteilung bei geschlechtlichen Vermehrung ablaufenden Vorgänge (Mitose, Meiose) fehlen Ablauf der Querteilung:  Zuerst beginnt die Zelle ihr Streckenwachstum und dabei erfolgt auch die Teilung des Zellkernes. Das ringförmig geschlossene Bakterienchromosom verdoppelt sich, so daß jede Tochterzelle ihr eigenes Chromosom erhält. Nach dieser Verdopplung der DNA (Replikation) erfolgt die eigentliche binäre Teilung der Bakterienzelle. Die Bakterienzelle teilt sich durch Einbau einer Querwand (Septum) - Die Zellmembran und später die Zellwand wachsen nach innen. Stets teilt sich eine ausgewachsene Zelle in zwei junge Tochterzellen. Zahlenmäßig betrachtet ergibt sich folgende geometrische Reihe -Vermehrungsrate: 2n 
• Physiologie des mikrobiellen Wachstums Latenzphase (Anlaufphase) Log-Phase / Exponentielle Phase Verzögerungsphase Stationäre Phase Absterbephase
• Latenzphase (Anlaufphase) Mikroorganismenzahl bleibt gleich In dieser Zeit stellen sich die Mikroorganismen auf das „neue“ Medium und die Umweltbedingungen ein bilden erst Enzyme, um die Nährstoffe aufzuspalten und verarbeiten zu können Kommen die MO aus einer stark Unterschiedlichen Umgebung, wird die Anlaufphase länger dauern. Gleiches gilt für (nicht tödlich) geschädigte Mikroorganismen (= subletal geschädigte Mikroorganismen) oder Mikroorganismen, die aus der stationären oder Absterbephase stammen. Nicht optimale Wachstumsbedingungen verlängern die Anlaufphase  Bei Kultur-Keimen ist eine kurze Anlaufphase gewünscht. Durch rasches Anwachsen wird die Kultur schädliche Mikroorganismen unterdrücken.
• Exponentielle Phase Kultur vermehrt sich explosionsartig - Die MO-Dichte wird immer höher raschere Abnahme der Nährstoffe, sowie eine exponentiell steigende Konzentration an Stoffwechsel- Schlacken. Ein weiterer bremsender Faktor kann die gegenseitige Beeinflussung derMikroorganismen, bedingt durch die extreme Zelldichte, sein. In dieser Phase ist die Beeinflussung von außen am größten
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• Verzögerungsphase Durch z. B Substratverarmung oder Anreicherung toxischer Stoffwechselprodukte, ist die exponentielle Phase zeitlich begrenzt. Die Vermehrungsgeschwindigkeit der Mikroorganismen nimmt ab.
• Stationäre Phase Keimzahl bleibt gleich groß Die Wachstumsgeschwindigkeit ist null Der Zuwachs an Mikroorganismen hält sich mit der Zahl der absterbenden Mikroorganismen die Waage Die Mikroorganismen betreiben jedoch noch Stoffwechsel, zum Beispiel nutzen sie Speicherstoffe
• Absterbephase Die Mikroorganismen ertragen keine hohe Konzentrationen der eigenen Stoffwechselprodukte  Bei langdauerndem Kontakt sterben sie ab Danach können sich die Zellen durch eigene Enzyme auflösen (Autolyse).
• Generationszeit die Zeit, die für einen Teilungsschritt benötigt wird Bei optimalen Bedingungen können viele Bakterienarten sich innerhalb von weniger als 20 Minuten verdoppeln Diese Art der Vermehrung bezeichnet man als exponentiell oder logarithmisch Kennt man die Generationszeit, kann man leicht errechnen, wieviel Bakterien nach einer bestimmten Zeit gebildet wurden Die Generationszeit (g) läßt sich mit der Formel g = t / n errechnen t = Vermehrungszeitn = Anzahl der GenerationenN = GesamtkeimzahlNo = Ausgangskeimzahl
• Warum ist Sauerstoff problematisch? Im Zuge von Elektronentransfer-Reaktionen kann es zur Übertragung von Einzelelektronen auf O2 kommen. Die entstehenden reaktive Sauerstoffspezies (Peroxid-Ion, Superoxid-Radikal, Hydroxylradikal) müssen unschädlich gemacht werden müssen.
• Superoxiddismutase kupferhaltiges Enzym, welches in den Erythrozyten vorkommt. Es enthält zusätzlich Zink und Mangan und dient der Entfernung von Sauerstoffradikalen um Superoxidion (hochreaktives Sauerstoffradikal) zu entschärfen, wird das überschüssige Elektron des Superoxidions durch die Superoxiddismutase auf sich selbst übertragen SODoxidiert + O2-° -> SODreduziert + O2 SOD muss wieder oxidiert/regeneriert werden - macht sie mit Hilfe eines weiteren Superoxidions und Wasserstoff: SODred + O2-° + 2H+ -> SODox + H2O2
• Katalase Enzym, das die Reaktion von Wasserstoffperoxid zu Wasser und Sauerstoff katalysiert Reaktionsgleichung: 2 H2O2 ---> 2 H2O + O2
• Zählkammer Zählkammer: plangeschliffene Glasplatte mit drei Stegen, die beiden äußeren Stege liegen höher als der mittlere legt man ein Deckglas auf, befindet sich zwischen diesem und dem mittleren Steg ein Hohlraum mit definiertem Volumen auf den mittleren Steg sind ein oder mehrere Netzquadrate eingeätzt zum Auszählen der Zellen bei der Thomakammer: 400 Kleinquadrate, je 16 zu einem Großquadrat zusammengefasst, 0,1 mm Schichtdicke, geeignet für Bakterien und Hefezellen die Zellen werden ausgezählt, die Kammer wird von unten nach oben und das Großquadrat in Schlangenlinien durchmustert Vor- und Nachteile der Zählkammer + geringer Zeitaufwand, schnelle Ergebnisse+ kaum apparativer Aufwand+ anhand Größe und Morphologie kann man Zellen schon bestimmen- Ungenauigkeit sehr groß (bis zu 50% Fehler) durch:  Verzählen  Mikropartikel etc. werden für Zellen gehalten und mitgezählt - keine Unterscheidung zwischen lebenden und toten Zellen
• Bestimmung der Lebendzellzahl „lebend“ inkorrekt, erfasst wird nur die Fähigkeit, sich zu vermehren  Zellen bilden unter günstigen Bedingungen Kolonien auf Nährmedien aus Grundlage: aus jeder Zelle entsteht eine Kolonie (in verdünnten Suspensionen) Zellen werden auf einem Nährmedium ausgebreitet nach einer Bebrütungszeit von ca. 24 Stunden werden die entstandenen Kolonien gezählt die Zahl der Kolonien = ursprünglichen Zahl der Zellen pro Platte geringe Anzahl von Kolonien pro Platte: Zählfehler wirken sich stärker aus zu hohe Anzahl von Kolonien: nicht jede Zelle bildet eine sichtbare Kolonie aus (gegenseitige Hemmung / Konkurrenz) Kompromiss: 100 bis 200 Kolonien pro Platte sind optimal
• Titerverfahren (MPN) Titer: in der Mikrobiologie das kleinste Probevolumen in ml, in dem noch Bakterien nachweisbar sind  eine Variante des Titerverfahrens ist das MPN-Verfahren (MPN: most propable number) eine Probe wird in einer Reihe von Dezimalschritten verdünnt: 10-1, 10-2, 10-3 etc. mit je 1 ml der Verdünnungen werden mindestens drei (besser sechs oder zehn) Röhrchen mit Nährlösung beimpft Kontrolle: ein Satz Röhrchen mit sterilem Verdünnungsmittel beimpfen Nach der Bebrütung wird für jede Verdünnung die Zahl der Röhrchen registriert, in denen Bakterien angewachsen sind (positive Röhrchen)
• Titerverfahren (MPN) - Bestimmung der Zellzahl Bakterien werden entweder als sichtbare Kolonien nachgewiesen oder durch den Nachweis eines typischen Stoffwechselprodukts Bei niedrigen Verdünnungen kann es dazu kommen, dass gar keine Bakterien anwachsen (negative Röhrchen) Es werden die drei Verdünnungsstufen gewählt, auf denen man noch positive Röhrchen findet Aus der Anzahl der positiven Röhrchen ergibt sich eine Zahlenkombination, der man eine wahrscheinliche Keimzahl (MPN) zuordnen kann Vorteile und Nachteile des Titerverfahrens- hohe Ungenauigkeit- zeit- und materialaufwendig- nur bei kleinen Flüssigkeitsvolumina möglich+ zu zählende Organismen müssen nicht auf Nährboden anwachsen können+ auch für Proben, in denen mehrere unerwünschte Begleitorganismen existieren (gewünschte Organismen werden über Stoffwechselprodukte nachgewiesen)
• Biomassebestimmung über Optische Dichte (OD) Steuung oder Absorption (= optische Dichte) Das Lambert-Beer´sche Gesetz als GrundlageE = log I0/Id.h. Extinktion 1 entspricht einem Restlicht von 10% (I0=100; I=10)Extinktion 2 entspricht einem Restlicht von 1% (I0=100; I=1) Angewandt auf den Streulichteffekt (Optische Dichte) ergibt sich ein Problem bei hohen Zelldichten. Hier ist die Gleichung nicht linear! Daher gilt Lambert-Beer´sche Gesetz nur für E<0.3. Bei höheren Dichten muss verdünnt werden!
• Pathogene Bakterien Bacillus antracis (Milzbarnd) Bacillus cereus Straphylococcus aureus (Entzündungen) Streptococcus mutans (Plaque) Streptococcus pneumoniae (Lungenentzündung) Steptokokken Sepsis Candida albicans Vibrio cholerae Pseudomonas aeruginosa Clostridium perfringens Clostridium tetani Clostridium botulinum Salmonella typhi Mycobacterium tuberculosis Mycobacterium leprae  Corynebacterium diphteriae Klebsiella pneumoniae
• Dauerformen Endosporen Exosporen Cysten Myxosporen
• Endosporen Meist im Boden lebende, Gram-positive Bakterien (oft Krankheitserreger) Dienen nicht der Vermehrung Keine Stoffwechselaktivität Mehr als 200 Gene sind an dem Prozess beteiligt Widerstandsfähig gegen Hitze, Austrocknung, extreme pH-Werte, Strahlung (Radioaktivität), Desinfektion & Chemikalien SASP-Proteine (small acid soluble spore protein) schützen die DNA und dienen als C- und Energie-Quelle Ca+-Dipicolinsäure im Sporencytoplasma (10-15% des TG) Widerstandsfähigkeit der Endosporen ist zurückzuführen auf extreme Dehydratisierung der Proteine (Sporen enthalten 15% Wasser), einen hohen Dipicolinsäuregehalt (hitzebeständig) und die Bildung mehrschichtiger Hüllen: -Sporenzellwand (Core)-Sporenrinde (Cortex)-Sporenhülle (Coat)-Exosporum (nur bei einigen Bacillen) Bildung: Hungerzustand→ Mangel an Guaninnucleotiden im Cytoplasma→ durch Endocytose ähnlichen Prozess Bildung einer Endospore innerhalb der Zelle
• Exosporen Ein Mittel der Vermehrung Zwei verschiedene Entstehungsweisen:- Konidien durch Septierung und Fragmentierung der Hyphen → keine Sporenhülle; beinahe vollständig ruhender Metabolismus; geringer Wasserhaushalt schützt gegen Hitze, Austrocknung und chemischem Stress → widerstandsfähiger als die vegetativen Zellen (Bsp. Actinomyceten)- Bildung durch Knospung → komplexe Sporenwand; umgeben von einer Kapsel; keine metabolische Aktivität (Bsp. Methylosinus und Methylocystis) Nicht so resistent wie Endosporen, jedoch effektivere Lebensweise bei ungünstigen Bedingungen als vegetative Zelle
• Cysten Gesamte Zelle wird zu Dauerform (Cyste) umgeformt Flagellen gehen der Zelle verloren um eine komplexe Cystenwand (aus Alginat, Protein und Lipiden) zu bilden Stoffwechsel bleibt bestehen wichtiger Speicherstoff ist dabei Poly-β-hydroxybutyrat Austrocknungs- und UV-resistent, aber - anders als Endosporen - hitzeempfindlich (Bsp. Azobacter vinelandii )
• Endosporen - Ablauf der Sporulation: Replikation des genetischen Materials Inäquale Zellteilung, Sporenteil entält nur ein Teil des Genoms Keine Zellwandbildung zwischen den beiden Protoplasten Sporenprotoplast wird von Cytoplasmamembran der Mutterzelle umwachsen und eingehüllt.→ Endocytose- ähnlicher Prozess Bildung der Sporenwand Hüllen machen 50% der Trockenmasse der Spore aus Stirbt Vegetative Zelle ab, wird Spore freigesetzt Keimung
• Lage der Sporen in Mutterzelle terminal (ganz außen) subterminal (teilweise außen) zentral
• Sterilisation steril oder keimfrei bedeutet „frei von vermehrungsfähigenMikroorganismen inkl. Sporen (und Viren)

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