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Agrarbiotechnologie (Subject) / Molekularbiologische Standardmethoden 2 (Lesson)
- Heterologen Expression das Protein stammt aus anderem Organismus, als dem indem es exprimiert wird
- Nachteile bakterieller Expressionssysteme - falsch gefaltete Proteine- funktionsverlust rekombinanter Proteine- Membranproteine meist toxisch für Bakterien- Fehlen posttranslationaler Modifikationen
- Blotten dauerhafter Transfer von DNA oder RNA auf eine Membran
- Southern Blot Transfer der DNA- Ziel: Nachweis bestimmter DNA Fragmente durch Hybridisierung-Beladen des Gels und Auftrennung- Transfer auf Nylonmembran- Hybridisierung bei 65 grad- Intubation mit Sonderlösung auf Southern Blot- auflegen eines Röntgenfilms
- Northern Blot gleiches Prinzip wie Southern Blot nur mit RNA- Ziel: Nachweis der Expressionsstärke eines Gens
- Denaturierung DNA in zwei Einzelstränge getrennt (94 grad)
- Hybridisierung (Annealing) Anlagerung der Primer an komplementärer DNA-Abschnitte (55-65 grad)
- Polymerisierung (Extensionsphase) DNA-Verlängerung mit dNTPs und Taq-Polymerase
- Sequenzierung der DNA nach Sanger = Didesoxymethode oder Kettenabbruchsynthese ist eine enzymatische Methode - Durch Primer und DNA-Polymerase wird in einer der beiden konplementären DNA-Stränge verlängert- in vier parallelen Ansätzen wird zu den 4 dNTPs je eine der 4 Basen als ddNTP hinzugegeben- Statischer Syntheseabbruch nach ddNTPs Einbau
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