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Arzneistoffanalytik (Subject) / Arzneistoffanalytik (Lesson)

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  • FTIR-Spektrometer? (Fourier-Transform)• alle Wellenlängen werden gleichzeitig angeregt• man erhält ein Interferogramm (Überlagerung vonSchwingungen, 'Zeitdomäne')• aus diesem wird durch eine mathematische Operation (Fourier-Transformation) das gewohnte IR-Spektrum erzeugt('Frequenzdomäne' = Frequenz (Wellenzahl) gegen Intensität)• Vorteil: viel schneller (Kopplung mit chromatographischenVerfahren möglich), empfindlicher (besseres Signal-Rausch Verhältnis), hohe Präzision (Eichung mittels Laser)
  • Aufbau eines Ft-IR Strahlungsquelle (Nernst-Stift; SiC-Globar), HeNe Laser I Strahlenteiler I stationärer Spiegel/ beweglicher Spiegel I  Schlitten mit Probe und Vgl.-Substanz I Detektor
  • Unterschied von Interferogramm und Spektrum Zeit- wird zu Frequenzdomäne durch die Fouriertransformation
  • Erklärung Massenspektroskopie? Im Massenspektrometer werden Moleküle die sich im Gaszustand befinden in Energiereiche positive (bzw. negative) Ionen überführt -> Ionisierung  Die gebildeten energiereichen Ionen zerfallen in geladenen und ungeladenen Bruchstücke -> Fragmentierung Die geladenen Teilchen werden in einem elektrischen Feld beschleunigt und nach ihrer Massenzahl m/z aufgetrennt und registriert. Nun werden Massenzahlen gegen ihre relative Intensität aufgetragen.
  • Aufbau Massenspektrometer? Substanz -> Einlaßsystem Ionisierung bis Analysator alles im Hochvakuum (10-6 - 10-8) Fragmentierug  Fokusierung Empfänger Verstärker  Schreiber Computer
  • Einlasssysteme für MS Direkt-Einlass ('Schubstange'): beheizbarer Tiegel für feste oder flüssige Proben, wird über Schleusenkammer in das Massenspektrometer eingeführt, dann wird die Probe verdampft (kombinierbar mit EI, CI, MALDI) Direkt-Infusion: Probe wird aus einem Vorratsbehälter über eine Kapillare dosiert und kontinuierlich in das Massenspektrometer eingeführt (besonders für Proben in Lösung bzw. bereits im gasförmigem Zustand) kombinierbar mit EI, CI, Spray-Methodenerlaubt die Kopplung mit chromatographischen Methoden (GC-MS, HPLC-MS)
  • Einlass von HPLC und GC in MS GC: für flüchtige Substanzen, GC-Trägergas mittels Jet-Separator größtenteils abgetrenntKombination einer Hochleistungstrennmethode mit einer Hochleistungsanalysenmethode, äußerst leistungsfähig HPLC: für polare Substanzen, Entfernung der polaren mobilen Phase und Ionisierung mittels Elektrospray-Verfahren (ESI)
  • Ionisierungsarten Entreißen eines Elektrons→ es entsteht ein Radikal-Kation der Ladung +1 (Molekül-Ion, M+•), sehr energiereich, fragmentiert stark, hauptsächlich bei EI Anlagerung eines Elektrons→ es entsteht ein Radikal-Kation der Ladung -1, weniger wichtig, nur für Moleküle mit hoher Elektronenaffinität (z.B. Halogenverbindungen) Protonierung→ durch Anlagerung eines Protons entsteht ein Kation [M+1]+vorzugsweise an ‚basischen‘ Stellen des Moleküls (Atome mit freien Elektronenpaaren wie Amine, O-Verbindungen),bei CI, ESI, APCI, MALDI (Positiv-Modus); oft auch [M+Na]+ Deprotonierung→ durch Entfernen eines Protons entsteht ein Anion [M-1]-, bei sauren Verbindungen (Carbonsäuren, Phenole),bei CI, ESI, APCI, MALDI (Negativ-Modus)
  • Ionisierungstechniken? Auswahl abhängig von• gewünschter Information• den Eigenschaften der Probe leicht verdampfbare Substanzen (Verdampfungsmethoden) Elektronenstoß-Ionisation (electron impact, EI) Chemische Ionisation (CI) → 'weiche' Ionisierungs-technik schwer verdampfbare Substanzen (Desorptionsmethoden) Feld-Desorption (FD)Fast Atom Bombardement (FAB)matrix-assisted Laser-Desorption (MALDI) Sekundärionen-MS (SIMS) Substanzen in Lösung (Zerstäubungsmethoden) Elektrospray-Ionisation (ESI)Atmospheric Pressure CI (APCI)Inductive Coupled Plasma (ICP)Desorption Electrospray Ionization (DESI) Atmospheric Pressure Photo Ionization (APPI)
  • Electron-Impact (EI) Ionisation und Fragmentierung Probe wird mit energiereichen Elektronen (70 eV) beschossen Ionisierung Molekül -> Molekülion Danach Fragmentierung: Heterolyse: Neutralmolekül + Radikalkation -> Radikalkation -> Radikalkation + Neutralmolekül oder Homolyse:  Molekülion -> Radikal + Kation  Kation -> Kation + Neutralmolekül
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  • Aufbau Electron impact ionisator Filament sendet Elektronenstrahl durch den Substanzdampf zum Elektronenauffänger Der dadurch entstehende Ionenstrom wird durch beschleunigungs elektroden beschleunigt und geht zum Analysator
  • Funktion der chemischen Ionisation Verwendung eines Hilfsgases CH4 -> (150 eV) -> CH4+. + e- CH4+. + CH4 -> CH5+ + CH3. CH5+ + M -> (M+H)+ + CH4 Für saure Verbindungen :  basisches Hilfsgas (z.B. NH3) -> negativ geladene Ionen (M-H)-
  • FAB (Fast Atom Bombardement) Aufbau? bombardierender Atomstrahl (Ar, Xe) -> Matrix (z.B. Glycerin) + gelöste Substanz auf Metallspitze  +kV für spektren positiver Ionen, -kV für negative Ionen auf der Spitze, die desorbierten Ionen werden nun zum Analysator beschleunigt  Nachteil -> Matrix kann stören
  • Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization (MALDI) Funktion Einbettung der Probe in kristalline Matrix (Matrix : Probe ca. 1000 : 1) Matrix-Moleküle müssen bei der Laser-Wellenlänge absorbieren, werdendabei photo-ionisiert und übertragen Protonen auf die Probe → [MH]+ Probenvorbereitung wichtig (Matrix muss für Probe ‚passen‘!)  Matrix: z.B. 2,5- Dihydroxybenzoesäure (DHB), Sinapinsäure (SA), 3-Hydroxy- picolinsäure (3-HPA), usw. Messbereich bis MG 1 000 000 (verteilt auf mehrere Bereiche), sehr mild! üblicherweise Kombination mit Flugzeit-Analysatoren (TOF)
  • Sekundärionen-MS (SIMS) Funktion Durch Beschuss mit energiereichen Ionen (Cs+, Ar+, Ga+) werden aus der Probe, die sich auf einer Metalloberfläche befindet, positive und negative Ionen erzeugt; für Peptide und Oligosaccharide, zur Analyse von Kontaminationen auf Oberflächen
  • Feld-Desorption Funktion Probe wird von einem aktivierten Draht (beschichtet mit feinsten Kohlenstoff-Nadeln) unter Einfluss starker elektrischer Felder desorbiert
  • Elektrospray-Ionisierung (ESI) Funktion die flüssigkeit wird am ende einer Kapillare eletrisch aufgeladen, beschleunigt und desolvatisiert und ionisiert auf dem Weg. 
  • Atmospheric Pressure Chemical Ionization (APCI) Funktion? Ähnlich ESI, aber keine Spannung auf der Spraykapillare, Ionisierung des Dampfgemisches (Probe plus N2) via EntladungsnadelVorteil gegenüber ESI: auch für apolare Verbindungen; Nachteil: höhere thermische Belastung
  • Inductive Coupled Plasma (ICP) Funktion? für Bestimmung von Elementen, Eluat trifft unter Inertgas auf ca.10 000 °C heiße Fackel, Zersetzung in atomare Bestandteile, Bildung von Atom-Ionen
  • Desorption Electrospray Ionization (DESI) Oberflächenanalyse (z.B. DC-Platten); geladene LM-Tröpfchen werden auf Versuchsfläche gesprayt
  • Atmospheric Pressure Photo Ionization (APPI) ähnlich APCI, Ionen werden aus dem Spray durch Bestrahlung mit UV-Lampe erzeugt, für lipophile, unpolare Substanzen
  • MS - Analysatoren magnetischer Sektor (Sektorfeldgeräte) Quadrupol-Analysator Ionenfalle (QIT) und Orbitrap time of flight (TOF) MS - Analysatoren Fourier transform Ionencyclotronresonanz (FT-ICR)
  • Kenngrößen eines Analysators Massenbereich (Messbereich, z.B. zwischen m/z 50-2000) Scangeschwindigkeit (Geschwindigkeit, mit dem derMassenbereich durchgescannt werden kann, z.B. 2000 m/z s-1)• Genauigkeit (Abweichung von der berechneten Masse desIons, ∆m/m) Auflösung: siehe 10% TAL-Definition
  • Magnet Analysator eines MS Funktion (Sektor Feld Gerät) Ion wird von einem Magnetfeld abgelenkt und nur bei einer gewissen Fubbahn den Analysator Massenbereich ~ 10-6000 geringe Scangeschwindigkeit
  • Auftrennung von Ionen im Magnetfeld Formel r=1/B * ((2*U*m)/z)1/2 r.....Flugbahnradius B....Magnetfeldstärke U....Beschleunigungsspannung m....Masse des Ions z....Ladung des Ions
  • Quadrupol-Analysator Wechselspannung ∼ wird so eingestellt, dass nur Teilchen einer ganz bestimmten Masse zwischen den Stäben 'durchkommen'∼Quadrupol-Analysator• Quadrupol-Feld zwischen 4 parallelen Metallstäben• arbeitet sehr schnell (→ GC-MS)• nicht für hohe Massen (bis ca. 4000 m/z) • relativ geringes Auflösungsvermögen
  • Quadrupol-Ionenfalle (Ion Trap, QIT, Paul-Falle) Funktion? • Ionenquelle und Massenanalysator befinden sich in einer gemeinsamen Kammer• positive Ionen werden durch ein Radiofrequenzfeld (Ring-Elektrode) in einem zylinderförmigen Behältnis 'gefangen'• nach einem Stablilisierungsschritt wird die Spannung an der Ringelektrode sukzessive erhöht und die Ionen nach steigender Masse freigesetzt und detektiert• Massenbereich 50-6000, hohe Scangeschwindigkeit
  • Orbitrap-Analysatoren •Ionen werden in elektrostatischem Feld gefangen, umkreisen die spindelförmige Zentralelektrode und schwingen gleichzeitig entlang der z-Achse in Abhängigkeit von m/z•Die Schwingungen erzeugen in den äußeren, gespaltenen Elektroden Signale, die mittels Fourier-Transformation in m/z-Werte umgewandelt werden•Vorteile: hohe Genauigkeit, hohe Auflösung, Massenbereich bis 6000 m/z, technisch viel weniger aufwendig als FT-ICR (keine Hochfeld-Magnete nötig)
  • Time of Flight (TOF) Analysator Massenbereich 10 - > 300 000, hohe Scangeschwindigkeit Bestimmung der Molekülmasse von Peptiden und Proteinen heute meist mittels MALDI-TOF TOF direkt proportional zu (m/z)1/2
  • Doppelt fokussierendes Massenspektrometer (Hochauflösung) Aufbau? EinlaßsystemeIonenquelleelektrostatische FokussierungMagnet-FokussierungEmpfänger
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  • Definition der Auflösung bei MS A=m/Δm Δm...unterschied der zu rennenden Massen 'normales' MS: A ca. 1000-2000 hochaufgelöstes (high resolution) MS:A ca. 150000! N2: 28.0061 CO: 27.9949 C2H4: 28.0313 mit HRMS unterscheidbar
  • nominale Masse? Summe der zu ganzen Zahlen gerundeten Atommassen einer Verbindung. Verbindungen gleicher nominaler Masse bezeichnet man als isobar(auch wenn sich diese in ihrer exakten Masse unterscheiden) z.B. N2, CO, C2H4– alle 28
  • exakte Masse die mit hoher Genauigkeit ( ≥4 Nachkommastellen, doppelt fokussierende Geräte) gemessene Masse: z.B. N2: 28.0061
  • isotopische Masse exakte Masse eines Isotops
  • monoisotopische Masse Masse jenes Teilchens, bei dem nur die häufigsten Isotope der jeweiligen Elemente zur Gesamtmasse beitragenKohlenstoff: 12C, 13C, (14C); Wasserstoff: 1H = H, 2H = D, (3H=T)Methan: Mmi entspricht exakter Masse von 12CH4; nicht: 13CH4, 12CDH3, 12CD2H2,12CD3H, 12CD4; 13CH4, 13CDH3, 13CD2H2, 13CD3H, 13CD4, 14CH4...usw......(14CT4).
  • ‚Molekulargewicht‘? Jener Massenwert, der sich aus der Summe der mittleren Massen der Elemente (über deren Isotopenverteilung gemittelt) ergibt – kann nicht direkt gemessen werden!
  • Basis-Peak (base peak)? größter Peak im Spektrum, wird als100% relative Intensität gesetzt, alle anderen Peaks werden in %des Basispeaks angegeben
  • Molkülionenpeak Unfragmentierte Probe
  • Isotopenpeaks - Nachweis bestimmter Elemente - Brom? Brom: Gemisch aus 2 Isotopen 79Br : 81Br 1 Brom-Atom im Molekül (z.B. HBr) : 1:12 Brom-Atome im Molekül (z.B. Br2): 1:2:1 79Br–79Br → MG 158 79Br–81Br → MG 160 81Br–79Br → MG 160 81Br–81Br → MG 162
  • Isotopenpeaks - Nachweis bestimmter Elemente - Chlor Chlor: Gemisch aus 2 Isotopen 35Cl : 37Cl, 3:1 1 Chlor-Atom im Molekül (z.B. HCl) : 3:12 Chlor-Atome im Molekül (z.B. Cl2): 9:6:1 35Cl–35Cl→MG70 W=3•3=9 35Cl–37Cl→MG72 W=3•1=3 37Cl–35Cl→MG72 W=1•3=3 37Cl–37Cl→MG74 W=1•1=1
  • 3 Chlor-Atome im Molekül MS 27 : 27 : 9 : 1 aaa X W = 3•3•3 = 27 aabababaa X+2 W=3•3•1+3•1•3+1•3•3=27 abbbabbba X+4 W=3•1•1+1•3•1+1•1•3=9 bbb X+6 W=1•1•1=1
  • Isotopenpeaks - allgemeine Formel (a + b)n a: leichteres Isotop b: schwereres Isotop n: Anzahl der Atome des isotopen Elementsa/b: Mengenverhältnis der Isotopen binomischer Lehrsatz:(a+b)1 =a+b(a + b)2 = a2 + 2ab + b2(a+b)3 =a3 +3a2b+3ab2 +b3Isotopenpeaks treten auch z.B. bei C auf, allerdings kaum auswertbar (12C : 13C ∼ 99 : 1) → sehr kleine 'Nebenpeaks' → 'Schotter' die Zahl der Glieder des Binoms gibt die Anzahl der Isotopenpeaks an, die Zahlen selbst das Verhältnis der Intensitätenz.B. für 2 Cl-Atome im Molekül: (3 + 1)2 = 9 + 2•3•1 + 1 = 9 + 6 +1
  • O, C, S, H, F, Cl, Br, I in Hinblick auf MS O, C, S gerade Wertigkeit und Gewicht H, F, Cl, Br, I ungerade Wertigkeit , ungerades Gewicht Ausnahme: N ungerade Wertigkeit, gerades Atomgewicht Verbindungen mit einer ungeraden Anzahl an N-Atomen haben stets ein ungerades Molekulargewicht!
  • Fragmentierungsverhalten bei EI-Ionisierung? 1.(AB).+ -> A. + B+ Molekülion -> neutrales Radikal + Kation mit gerader Elektronenzahl 2.(AB).+ -> AI + B.+ Molekülion -> neutralteilchen mit gerader Elektronenzahl + Radikalkation Weg (1) energetisch meist bevorzugtWeg (2) bevorzugt, wenn besonders stabiles Neutralteilchen(H2O, N2, CO) entsteht
  • Einige charakteristische Neutralteilchen, die aus M+• abgespalten werden? H Aldehyden M-1 CH3 Methylverbindungen M-15 H2O Alkoholen M-18 C2H4 CO ex McLafferty M-28 N2CHO Aldehyden M-29 C2H5 Ethylverbindungen M-29 OCH3 Methoxyverbindungen M-31
  • homolytische Spaltung in α-Stellung zu einer C-Heteroatombindung (α-Spaltung)? In Hinblick auf MS prim. Alkohole: R–CH2–OH+• → R• + H2C=OH+ (m/z = 31)prim.Amine: R–CH –NH2 +• → R• + H C=NH2+ (m/z=30) Aldehyde: RCHO.+ -> R• + H–C≡O+ (m/z = 29), H• + R–C≡O+ (M+-1) Methylester: R-CO.OCH3 -> R• + |O≡C-OCH3+ (m/z = 59) R-CO.OCH3 -> OCH3• + R–C≡O|+ (m/z = M+-31)
  • Benzyl-, Allylspaltung ? siehe Block
  • Mc-Lafferty Umlagerung siehe Block
  • Retro-Diels-Alder Reaktion (RDA) siehe Block
  • Onium Reaktion siehe Block

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