Molekulare Tierzucht (Fach) / Genkartierung (Lektion)

Unterschiede zwischen genetischer und physikalischer Kartierung

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• Genom Die Gesamtheit der genetischen Informationen im haploiden Chromosomensatz
• Gen Funktionseinheit der DNA, in der die kodierenden wie auch die regulatorischen Sequenzen für ein Protein, eine rRNA oder eine tRNA lokalisiert sind.
• Allele eine durch Mutation entstandene Variante eines Gens Die auf homologen Chromosomen liegenden entsprechenden Gene betrachtend Ein Tier kann höchstens zwei Allele an einem Genort haben (Paternales und maternales Allel)
• Homozygot reinerbig --> Das Tier hat von Vater und Mutter die gleiche Variante geerbt
• Heterozygot Mischerbin --> Das Tier hat von Vater und Mutter unterschiedliche Varianten des Gens geerbt
• Genotyp: Allelkonstellation an einem bestimmten Genort oder an mehreren Genorten
• Gametentyp/ Haplotyp Anordnung der Allele innerhalb eines Chromosoms --> Zwei Haplotypen fusionieren bei der sexuellen Fortpflanzung zu einem Genotyp (Zygotentyp)
• Crossing-Over reziproker Stückaustausch zwischen homologen Chromosomen während der meiotischen Prophase → führt zu einer intra-chromosomalen Rekombination Fehler beim Crossing-Over: Übereinanderliegen von nicht homologen Chromosomen; Deletionen, Insertionen → Kann zur Evolution von Genfamilien beitragen, aber auch zu Gendefekten führen
• Kopplung Benachbarte Position zweier Loci auf einem Chromosom und gemeinsame Vererbung → Je näher die Positionen beieinander liegen, desto häufiger werden sie gemeinsam d.h. gekoppelt vererbt
• Was ist Genomkartierung? Synonyme: Genkartierung; Genome/ gene mapping - Identifizierung von Positionen (Loci) von Erbanlagen (Gene, Marker) auf einem Chromosom - Messung der Abstände zwischen den einzelnen Positionen (in versch. Maßeinheiten)
• Verschiedene Methoden zur Genomkartierung Genetische Kartierung: Kopplungsanalysen zur Erstellung von genetischen Karten Physikalische Kartierung: Chromosomenbänderungstechniken Zellhybridisierungstechniken (somatische Zellhybridisierung; Bestrahlungshybriden) In-situ-Hybridisierung Sequenzkarten
• Für was wird die Genomkartierung gebraucht? Identifizierung von Genen bzw. QTLs, die mit einem züchterisch bzw. ökonomisch bedeutenden Merkmal assoziiert sind Identifizierung von Krankheits- und Defektgenen Marker-gestützte Selektion (MAS) Entwicklung von vergleichenden Karten
• Marker für die Genomkartierung Marker muss mit bestimmter Chromosomenposition assozieert sein Für die genetische Kartierung muss der Marker polymorph sein (nicht für physikalische Kartierung) verschiedene Markertypen Gewünschte Eingenschaften: Polymorphiegrad: Zahl und Frequenz der Allele pro Locus Möglichst direkte Identifikation des Genotyps Vertretbarer experimenteller Aufwand zur Darstellung des Genotyps Geringe Fehlerrate bei der Genotypisierung
• Markertypen Morphologische Marker: Farbe, Farbverteilung, Phänotypen von Gendefekten Marker der Chromosomenstruktur: Chromosomenbänderung Immunologische Marker: Varianten der Antigene und Immunglobuline Biochemische Polymorphismen: Proteinvarianten DNA-Marker: Darstellung von DNA-Varianten
• Biochemische Polymorphismen Alle Varianten in Proteinen Nachweis durch Elektrophoresen, z.B. isoelektrische Fokussierung Vor Einsatz der DNA-Analysen die wichtigsten Marker in der Tierzucht (Einfach darstellbar, zahlreich, in enger Beziehung zum jeweils exprimierten Gen) Heute v.a. durch DNA-Marker ersetzt
• DNA-Marker Locus-spezifische Unterschiede in DNA Sequenz Zahlreich, gleichmäßig über das Genom verteilt Durch zahlreiche Techniken darstellbar hauptsächliche Marker bei Genomkartierung Typ-I-Loci: innerhalb oder eng flankierend zu exprimierten Genen Meistens SNPs (single nucleotide polymorphism) Typ-II-Loci: unbekannte Funktion z.T. auch als "Sequenz Tagged Sites" (STS) bezeichnet v.a. Mikro- oder Minisatelliten
• Genetische Kartierung = Kopplungsanalyse, "Linkage Mapping" Einheit: Ceni-Morgan (cM) → basiert auf Rekombinationsraten = relative Häufigkeit an Crossing-over pro Meiose zwischen den jeweiligen Markern → führt zu einer Kopplungskarte → Informative Marker und Tiergruppen nötig
• Informative Marker (genetische Kartierung) Können alle Markertypen sein Voraussetzung: sie müssen polymorph sein, d.h. verschiedene Allele haben PIC = polymorphism information conten
• PIC Wahrscheinlichkeit eines Markers für genetische Kartierung informativ zu sein Informativität umso höher: je ähnlicher die Frequenzen der verschiedenen Allele eines Locus (z.B. Allel A 0,35; Allel B 0,32; Allel C 0,33) je mehr Allele vorkommen (biallele Marker; d.h. nur zwei Allele --> PIC max. = 0,375);( Marker mit 30 Allelen: PIC >0,90) Ziel für genetische Kartierung: PIC > 0,75
• Informative Tiergruppen die betrachteten Loci müssen verschiedene Allele haben das gemeinsame Auftreten von Allelen verschiedener Loci in einem Chromosomen sollte von der Häufigkeit der Crossing-Over abhängen (F2- oder Rückkreuzungsgeneration oder Kreuzung genetische diverser Rassen, die sich in vielen Allelen unterscheiden) mind. ein Elternteil am Locus heterozygot Nötige Anzahl Tiere je nach Informativität der Marker unterschiedlich
• Heterozygotiegrad H Der Heterozygotiegrad eines Markers gibt die Wahrscheinlichekeit an, mit der ein zufällig typisiertes Tier aus einer Population für den betreffenden Marker heterozygot ist
• Centi-Morgan (cM) 1 cM Rekombinations- (Crossing-over-) Warscheinlichkeit = 1% pro Meiose; in 100 Meiosen 1 Crossing-over Die Wahrscheinlichkeit einer Rekombination zwischen zwei DNA-Loci nimmt proportional mit ihrem Abstand zu Je geringer der Wert in cM, desto enger sind die Marker gekoppelt
• Kopplungsanalyse Crossing-over Raten nicht direkt visuell zählbar; schwierig mit absoluter Sicherheit zu sagen, wie viele Crossing-over passiert sind Mit Hilfe der Kopplungsanalyse lassen sich die Crossing-over Wahrscheinlichkeiten zwischen zwei Markern schätzen
• Kartieren von Genorten Problem: Wie kann festgestelt werden, ob zwei Genorte gekoppelt sind oder nicht? Lösung: Nachkommen typisieren und die Verteilung der Genvarianten analysieren → Bei ungleicher Genotypverteilung der Nachkommen: Kopplung der Genorte; der am häufigsten vorkommende Genotyp ist der parentale → Abstand zwischen den beiden Genorten? Prozent der Rekombination
• Entwicklung von Kopplungskarten Basierend aud der Anordnung und den Abständen der Loci wird entsprechend der cM-Werte zwischen den Markern eine lineare Kopplungskarte erstellt 1. Schritt: Gerüstkarten (framework map): geringe Anzahl an Loci aber: hohe statistische Absicherung für ihre Platzierung 2. Schritt: Umfassende Karten (comprehensive map): Alle verfügbaren Marker werden in die Karte mit einbezogen; Neue Marker in der Nähe bekannter Marker werden entwickelt; hohe Auflösung → hohe Anzahl an Loci
• Einflüsse auf die Rekombinationsraten Genetische Karten beruhen in ihrer Länge auf den Rekombinationsraten zwischen Markern; Für das gleiche Chromosom und die gleiche Tierart können genetische Karten unterschiedlich lang sein --> WARUM? Geschlecht (Höhere 0 bei weiblichen Tieren -> weibl. Tiere i.d.R. um 30-40% länger als männl. Karte) Alter bei Meiose Rasse Temperatur Chemische Mutagene Röntgenstrahlung Genetsche Faktoren: Regionen mit gesteigerter Rekombination (recomination hot spots); Regionen mit niedriger Rekombination (recombination cold spots); spezifische Gene können Rekombination beeinflussen Selektion
• Physikalische Kartierung Einheiten: Abstände zwischen Chromosomenbändern; centi-Ray (cR); Anzahl der Nukleotide (in Basenpaaren, bp) Lokalisation der Marker im DNA- Molekül Detaillierte Genomanalyse
• Physikalische Karten und ihre Auflösung Drei Haupttypen unterscheidbar: Zytogenetische Karten RH-Karten Sequenzkarten Zytogenetische Karte: Auflösung gering RH- und Sequenzkarten höhere Auflösung Je höher die Auflösung, desto besser das Bild!
• Techniken zur Erstellung physikalischer Karten Chromosomenbänderungstechniken Zellhybridisierungstechniken (Somatische Zellhybridiserung; Bestrahlungshybriden) In-situ-Hybridisierung (Fluoreszenz- /FISH; radioaktiv)
• Chromosomenbänderungstechnik Chromosomenbänderung: Lichtmikroskopisch unterscheidbare Strukturen der Metaphasenchromosomen Verschiedene Verfahren Auflösung bis zu 3 x 103 kb (ca. 3 cM) erreichbar Chromosomenbänderungskarten = Zytogenet. Karte --> für viele Tierarten verfügbar Chromosomen einer Zelle können damit zuverlässig erkannt werden --> international standardisiert (Krayotyp)
• Zellhybridisierungstechniken 1. Somatische Zellhybridisierung zur Erzeugung zytogenetischer Karten Fusion von somatischen Zellen (Körperzellen) unterschiedlicher Spezies in vitro -> Bildung von Hybridzellen Donorzellen: Körperzellen (z.B. Fibroblasten) von der Spezies, die untersucht werden soll (z.B. Rind, Schwein) Rezipientenzellen: Zellen, die mit den Donorzellen fusionieren sollen; behalten bei dieser Methode ihre Chromosomen; stammen z.B. aus Tumorgewebe von der Maus Donor- und Rezipientenzellen werden gemeinsam kultiviert --> Zellfusion -->Heterokaryon --> Zellfusion --> Hybridzelle Chromosomen der Rezipientenzelle bleiben erhalten Die meisten Chromosomen der Donorzelle gehen verloren Isolation solcher Zellkerne, die nur ein oder wenige der Donorzell-Chromosomen und das gesamte Genom der Rezipientenzelle enthalten Somatisches Hybridzell-Panel → Anordnung von Hybridzellklonen mit verschiedenen Donorchromosomen (z.B. Schwein/Maus- oder Schwein/Hamster- Zelllinien) -> Zuordnung von Genen zu bestimmten Chromosomen möglich -> Kartierung innerhalb eines Chromosoms aber nicht möglich
• Zellhybridisierungstechniken 2. Bestrahlungshybriden (Radiation Hybrid Panel) Erzeugung von zufälligen chromosomalen Fragmenten in den Donorzellen Zellfusion der Donorzelle mit Rezipientenzelle und -selektion (nur Hybridzellen können im Medium wachsen) Analyse der Hybridzellen In den Hybridzellen reduziert sich die Zahl der Donorzell-Chromosom-Fragmente mit fortschreitenden Teilungen Untersuchung der Hybridzellen auf locus-spezifische DNA-Sequenzen durch PCR und Southern-Blotting Gemeinsames Vorkommen von zwei Loci in einem Zellklon (-> Hinweis auf Kopplung, weil je näher zwei Loci auf einem Chromosom liegen, umso häufiger sind sie in einem Bruchstück erhalten) Vorteil: Nicht nur Zuordnung zum Chromosom sondern auch Kopplung feststellbar; Durch Kartierungsfunktion Berechnung der Markerabstände möglich Einheit: cR (cenit-Ray); keine konstante Einheit; abhängig von der gewählten Bestrahlungsdosis
• Centi Ray Je höher die Bestrahlungsdosis, desto mehr Brüche entstehen 1 cR4000 = 2 Loci werden bei einer Dosis von 4000 rad mit einer Wahrscheinlichkeit von 1% getrennt Berechnungen der Karten mit Computerprogrammen
• Vergleich: genetische Karten - RH Karten (radiation hybrid / Bestrahlungs-) Genetische Karten: Basis= Rekombinationsraten; recombination-hotspots -> Karte wird länger in diesen Bereichen RH-Karten: Basis = Chromosomenbrüche; wahrscheinlich, dass manche Regionen brüchiger sind als andere --> Karte wird länger in diesen Bereichen Reihenfolge der Marker kann unterschiedlich sein RH-Karten geben den reellen Abstand zwischen den Markern genauer an als genetische Karten
• In-situ-Hybridisierung 1. Fluoreszenz (FISH) 2. radioaktiv Nachweis von DNA-Sequenzen direkt in den Chromosomen Behandlung fixierter, denaturierter Metaphase-Chromosomen mit bekannten einzelsträngigen markierten DNA-Sonden Sonden hybridisieren an den komplementären Chromosomenregionen Nach Waschschritt bleiben nur spezifisch gebundene DNA-Sonden an komplementären Chromosomenabschnitten haften Sichtbarmachung der Sonden-DNA durch: Radioaktive Markierung und anschließende Autoradiographie oder Fluoreszenz und Mikroskop -> Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) Prinzip: Chromosomen müssen unterscheidbar sein damit Zuordnung der Signale möglich ist -> Bänderung: vor, nach oder während der Hybridisierung --> zytogenet. Karte
• Radioaktiv vs. Fluoreszenz Nachteile Radioaktivität Dauer der Methode Arbeitssicherheit Vorteile Fluoreszenz (FISH) schneller mehrere Farbstoffe gleichzeitig einsetzbar: einzelne Loci können simultan detektiert und zueinander physikalisch zugeordnet werden -> Multicolor-FISH/ Chromosome painting
• Vergleich der versch. Kartierungstechniken Jede Kartierungsmethode hat Vor- und Nachteile Kombination der Methoden -> Verbesserung der Kartengenauigkeit bzw. Identifizieren von bestimmten Genen in verschiedenen Spezies Für in physikalischen Kartierung genutzte Marjer z.T. auch versch. Allele bekannt --> dann i.d.R. auch genet. kartiert Mit diesen Markern sind dann Vergleiche zwischen genet. und physik. Karten möglich -> nur mit Computer möglich
• Zusammenhang zwischen genetischen und physikalischen Karten In der Regel: 1cM -> ca. 106 bp = 103 kb ABER Physikalisch eng benachbarte Loci können an chromosomalen Bruchpunkten liegen -> große genetische Distanz Physikalisch weit entfernte Loci können funktionell gekoppelt sein -> geringe oder keine genetische Distanz
• Vergleichende Kartierung Vergleich der Genanordnung zwischen Chromosmen verschiedener Spezies Ähnliche Anordnungen einzelner Loci können auf den Chromosomen nachgewiesen werden Homologien zwischen den Genomkarten sind v.a. phylogenetisch zu erklären Chromosomenzahlen und -strukturen zwischen verwandten Spezies ähnlich Bestimmte Gengruppen (Gencluster) sind zwischen den Spezies konserviert und weisen eine ähnliche Anordnung auf, z.B. Milchproteine Information von markerreicher Karte für markerarme Karte (Maus/Mensch ↔Nutztiere) Ist Locus in einer Spezies karterit können u.U. homologe Segmente in weiteren Spezies identifiziert werden
• Synthänie = Zuordnung der Loci zum jeweils gleichen Chromosom in versch. Spezies
• Homologe DNA-Bereiche hohe Übereinstimmung in der Sequenz; unterteilen sich in Orthologe DNA-Bereiche: kommen in verschiedenen Spezies vor (z.B. Mensch und Rind), haben hohe Übereinstimmung in der Basensequenz Nachfolger einer gemeinsamen Ausgangssequenz bzw. eines Vorläufergens Paraloge DNA-Bereiche kommen in derselben Spezies/ demselben Genom vor, zeigen ebenfalls hohe Übereinstimmung in der Sequenz In der Evolution entstandene Vervielfältigung einer Ausgangsfrequenz -> Genfamilien

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