Pilze, Viren, Genetik bei Prokaryoten

Mikrobiologie (Fach) / Pilze, Viren, Genetik bei Prokaryoten (Lektion)

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Uni Bonn WS '16/'17

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Was versteht man unter Pilze? Eukaryonten Chemoheterotroph Aerob oder fakultativ anaerob Chitin als Zellwandpolymer ( ≠ Cellulose in Pflanzen ≠ Polygycon in Bak.) Bedeutung: Wichtige Rolle als:a) Mycorrhiza – am Wurzel der Pflanzen um Nährstoffe aus dem Boden zu mobilisierenb) Polymerabbauer – Enzymewerden bei Jeansproduktion benutzt, um den blauen Farbstoff abzubauen ⇒ Stonewash-Jeans c) Lebensmittelproduktion – z. B Alkoholproduktion, Vereedlung bei Milchproduktiond) Biotechnologie – Herstellung von Antibiotika, z. B. Penicillin, Citronensäure, Cellulase-Enzym bei Kleidung Produktion.e) Pathogene – Infektions-Auslösend
Wie werden Pilze differenziert werden? 1. Hefe: Einzellig Deutlich größer als Bakterien Oft fakultativ anaerob Vermehren sich durch Knospung,– bis 20 je Mutterzelle, erst kleine Ausstülpungen, die sich zu ausgewachsenen, Zellkugeln entwickeln und sich dann von der Mutterlösen ablösen 2. Schimmelpilze: Sporenkörper Filamentöses (fadenförmig) Wachstum = Hyphen → Wachstum an der Hyphenspitze (Aufbau neuer Biomasse) Hyphen mit oder ohne Septen (Scheidewand) → Vegetative Hyphen, Reproduktive Hyphen Sporen als Verbreitungsstruktur → ≠ Sporen bei Bakterien = Dauerform z. B Rhizopus = Brotschimmel
Was ist für den Lebensmittel-Industrie relevant im Bezug auf unerwünschte Stoffwechselprodukten von Pilzen? Mycotoxine: (= Schimmelpilzgifte) Sekundäre Stoffwechselprodukte, die beim Wachstum von Pilzen auf Lebens- und Futtermitteln gebildet werden können Toxisch für Menschen & Tier (beschränkt sich nicht auf Species) von 400 Toxine, sind 20 für LM-Relevant Chemisch vielfältig, Heterocyklische Verbindungen Stabil Umwandlung in toxischere Produkte im Rahmen des Abbaus im Körper werden in nochtoxischere Produkte umgewandelt Mykotoxinproduzenten 􏰀⇒ Hauptsächlich von Pilzen der Gattungen: – Penicillium (kann Getreide in jedem weiteren Zustand befallen) – Aspergillus – Fusarium (oft auf Felder, Getreide kontamination) Mycotoxine sind strukturell anders aufgebaut als Bakterientoxine!!!
Eintragswege von Mykotoxine! Wachstum auf dem Lebensmittel Verarbeitung von Kontaminierter Rohstoffe/ Zwischen Produkten Über Carry-Over:– Nutztiere nehmen verschimmelte Lebensmittel auf & geben die enthaltenen Gifte an die Produkte weiter: Milch, Eier, Fleisch Selten: LM-Produktion mit toxinogenen Stammenz. B. Käse, Wurst
Eigenschaften von Aflatoxine? Aflatoxine: natürlich vorkommende Pilzgifte (Mykotoxine) = Gattung Aspergillus Kanzerogen (z. B Leberkrebs) Chronische Toxizität (bei wenig Konz.- aber lagen Zeit brauchen) z. B. Leberzirrhosen, -tumore, -fibrosen Teratogen (Missbildung / Absterben von Föten) Heterozyklische Verbindungen (Eigenschaft d. Mycotoxine) → Kein Lipid, FS, AS, Zucker vorhanden zu idenstifizieren z. B. i) In Getreide: G1 ≠ G2 , B1 ≠ B2 (G:Grün, B:Blau flourenz) ii) Milchprodukte: M1, M2 : Metabolite, noch toxisher als G1,2, B1,2 B1 kontaminiertes Futter wird als Entgiftungsreaktion hydroxyliert → entsteht M1 → gelangt bei laktierende Tiere (auch Mensch) in die Milch → Zulässiger Hochsgehalt von B1 in LM = 2 μg/kg mit Ausnahmen z. B. Ölsaaten vor Verarbeitung = 8 μg/kg Hitzestabil (100-200°C) aber empfindlich gegenüber stärkeren Säuren & Laugen z. B. Getreide Verarbeitung Bildung: Kontaminierte Lebensmittel:– Tropische & Subtropische Nüsse (Erdnüsse)– Schalenfrüchte (Pistazien, Mandeln)– Früchte (Feigen)– Gewürze (Chillies)– Getreide (Mais)
Eigenschaften von Trichothecene Trichothecene: Hauptproduzent: Pilze der Gattung Fusarium → “Feldpilze“ = Infektion von Getreide (Weizen 61%, Mais 89%, Hafer) & Nutzpflanzen (Tomaten, Spargel, Bananen) während der Vegetationsperiode auf dem Feld. Bekannt: a) Typ A = T-2 Toxin → erzeugte bei einigen Tierarten (Rind, Maus, Schwein) die Gabe Magenbluten, Durchfall und Schläfrigkeit. → Eine krebserzeugende Wirkung bei verschiedenen Tieren ist nachgewiesen. b) Typ B = Deoxy-nivalenol (DON) = bedeutendsten heute im Getreideanbau – am häufigsten vorkommende Mykotoxin in Nahrungs- & Futtermitteln ist. Trichothecene sind starke Hemmstoffe der Proteinsynthese der Nutpflanzen → wirken daher zellschädigend, sind aber nicht erbgutschädigend, Vergiftung: (Deoxynivalenol)–Als für den Menschen nicht krebserzeugend eingestuft, sind hauttoxisch & greifen zunächst den Verdauungstrakt an; – aber auch das Nervensystem & die Blutbildung werden beeinträchtigt.⇒ Erbrechen, Durchfall & Hautreaktionen die häufigsten Beschwerden bei Trichothecenaufnahme durch die Nahrung.– stören das Immunsystem & führen dadurch zu erhöhter Anfälligkeit gegenüber Infektionskrankheiten.
Arten von Mycotoxine 1. Aflatoxine: von Gattung Aspergillus 2. Trichothecene: von Fusarienpilze (Fusarium)
Sind Viren eine Lebewesen? Was versteht man darunter? Sind sie eine Lebewesen? Jaein Nein, da sie weder eine eingeständige Replikation noch eine eigenen Stoffwechsel besitzen & sind deshalb auf den Stoffwechsel einer Wirtzelle angewiesen. Ja, da sie zumindest als "dem Leben nahestehend" betrachten werden kann, denn sie besitzen allgemein die Fähigkeit zur Replikation & Evolution. Aufbau:i) Eine Nucleinsäure (RNA / DNA) niemals beidesii) Kapside (Protein Hülle der Nucleinsäure) – Einzelne Protein-Untereinheit des Kapsids = Kapsomer → Nachtes Virus oder plus +iii) Virus mit Hülle (Membran): besteht aus Lipiden und darin eingelagerten viralen Proteinen → Virus mit Hülle Größe: 20-300 nm (Knapp unter Bakterien) Genom: 5-230 kB Keinen Stoffwechsel wenn sie in infiziertt Form vorliegt.
Was versteht man unter Virensystematik? Virensystematik: Unterscheidung zwischen: DNA- & RNA-haltige Viren DNA-Viren: Ohne Hülle / mit Hülle – Papovaviren (ohne Hülle): Papillomaviren → 􏰍Warzenbildung– Herpes-Viren (mit Hülle): Herpes-simplex → 􏰍Herpesbildung – Pockenvirus (mit Hülle) RNA-Viren: können singlestrang ss / doublestrang sein, ds findet nur bei Viren.– Picornaviren (ohne Hülle): Poliovirus– Togaviren (mit Hülle); Gelbfiebervirus → lösen hämorrhagisches (Blutung) Fieber aus –– – Rhabdovirus (mit Hülle): Erreger der Tollwut – Retrovirus (mit Hülle): Erreger HIV (AIDS)
Wie können Infektiöse Viren quantifiziert werden? Quantifizierung (Nachweis) von Phagen (Viren) = Plaquetest (Plaque-Assay) bei dem eine zu untersuchende Probe in unterschiedlichen Verdünnungen in eine Zellkultur eingebracht wird. Aufgrund cytopathischen Effektes kommt es bei einigen Viren zur Lyse von infizierten Zellen. Nach angemessenen Zeit wird der Zellrasen für die Virusvermehrung fixiert & gefärbt ⇒ erkennt man diese Lyse an leeren, nicht-gefärbten Stellen (Plaques) diese werden gezählt & dienen als Maß für die Menge an infektiösen Viren (Infektiöse Einheiten, IE) in der aufgebrachten Probe. Verfahren: Mischung von geschmolzenen Weichagar + bakterielle Zellen + verdünnte Phagensuspension wird auf einen mit Agar verfestigtem Nährboden Platte eingegossen.→ Nährboden & Weichagarschicht in dichtem Kontakt Bebrütung Entsteht Bakterienrasen (Bakterien = Wirtszellen für Bakteriophagen)→ einzelne Löcher 􏰍= jeder „Hof“ steht für einen Viruspartikel (Virus zerstört hier Zellkultur, 1 einzelner Fleck = 1 einzelner Viruspartikel)
Wie wird eine virulente Phage sich repliziert? Durch den Lytischer Zyklus eines Virusteilchens (= Virion) Wirtsspezifische Anheftung an Lipopolysaccharide auf der Oberfläche des Bakteriums Penetration & Injektion Synthese von viralen Nukleinsäuren & viralen Proteinen = latente Phase, kein Nachweis der Viren. Strukturaufbau & VerpackungSelbstorganisation: Entstehung von Viruspartikeln (eigenständige Synthese) Lyse, endet mit Tod der Wirtszelle & Freisetzung der Virusteilchen in umliegende Zellen
Erklären Sie die einzelnen Stadium der Virusreplikation Latente Periode: Keine funktionsfähigen Viren nachweisbar 1) Eclipse: Frühe Enzume, Nucleinsäure gebildet2) Reifung: Proteinhülle gebildet 2. Phase:3) Anfehtung & Freisetzung: steigt die Zahl funktionsfähiger Viren an → Freisetzung intakter Viruspartikel (= Virionen) → Wurfgröße: Anzahl von Virionen, die aus einer Zelle freigesetzt werden Kurz nach der Infektion einer Wirtszelle liegt ein Virus nicht mehr in seiner infektiösen, partikulären Form (Virion) vor, – da die virale Nukleinsäure vom Kapsid & der Virushülle getrennt wurde. Die Freisetzung der Nukleinsäure ist notwendig, damit virale Proteine hergestellt werden können. Die Eklipse ist daher definiert als das Stadium zwischen der Freisetzung des viralen Genoms nach Infektion & dem Beginn des Zusammenbaus neuer Viruspartikel. Während der Eklipse können keine infektiösen Viruspartikel in der Zelle nachgewiesen werden.
Wie wird temperente Phage sich repliziert? Temperente Phage = a) Lytischer ODER b) Lysogener Zyklus a) Lytischer Zyklus: Virusnukleinsäure wird abgelesen, neue Proteine & Viren werden erzeugt, Bakterienzelle wird lysiert. b) Lysogener Zyklus: – Virusnukleinsäure werden in DNA der Zielzelle (als Prophage) integriert & mitrepliziert & Wirstzelle verteilt sich. – Virus-DNA produziert ein System, was erfassen kann, wie der metabolische Status der Zelle ist. → Wenn es Zelle schlecht geht (Stresserscheinung): Virus induziert lytischen Zyklus &􏰍 vermehrt sich anschließend selbst (= lytischer Weg) Analog beim Menschen: Retroviren = Aidsvirus *(Prophage = Phagen-DNA, die in das Genom von Bakterien eingebaut wurden)
Was versteht man unter das Influenzavirus? Influenzavirus: Grippevirus : 1. H1N1(Mensch) 2. H5N1(Vogel) gehört zur Familie des Ortho-myxo-virus (Myxa = Schleim); – Zu den Orthomyxoviridae gehören Virusgattungen, die hauptsächlich über Tröpfcheninfektion das respiratorische System eines Wirts infizieren und sich darin vermehren. Verschiedene virale Proteine; – enthalten Virale RNA-Polymerase (da Wirtszelle keine virale RNA ablesen kann) die die virale RNA in mRNA des Wirtes kopiert → ermöglicht Synthese viraler Protein in Wirtzelle Negativ-Strang RNA– Muss erstmal in POSITIVES RNA-Strang umgewandelt werde.– 8 RNA-Fragmente/Genom Lipidhülle mit Proteinen: (= anfällig für Antigenshift)a) Hämagglutinin: → Anheftungsprotein, heftet sich an Sialinsäure (wird erkannt)an Zelloberflächen von Schleimhautepithelzellen & Erythrozyten an.b) Neura-minidase: → zerlegt Sialinsäure; wichtig beim Abknospen, da sich Viruspartikel von der Zelle lösen muss.⇒ Antigendrift: Mutation in Neura-minidase oder Häma-gglutinin ⇒ jährlicher Impfstoffwechsel Antigenshift:- Bei Austausch/Kombination der RNA zweier Influenzavirusstämme →􏰍 neuer Virusstamm →􏰍 􏰍Proteinveränderung, da neue vRNA →􏰍 􏰍Resistenzbildung →􏰍 􏰍 Pandemieentstehung!
Wie wird das Erbgut bei Prokaryoten weitergegeben? Horizontal Gentransfer (Selber Generation) = Neue Rekombination von Gene
Replikation vs. Transkription & Translation 1.ReplikationVervielfältigung des Erbinformationsträgers DNA in einer Zelle nach einem semikonservativen („halb-erhalten“) Prinzip. 1.Transkription– Übersetzung der DNA = Umschreiben eines Gens von DNA in RNA ⇓2. Translation – Synthese von Proteinen anhand der auf mRNA-Moleküle kopierten genetischen Information
Genetik Material: - Eukaryotische Zelle - Bakterien (Prokaryonten) - Viren Eukaryotische Zelle = Chromosomen (bestehen aus Chromatin) Bakterien (Prokaryonten) = Bakterienchromosom (lang) &/ Plasmid (kurz) Viren = Virale DNA
Allg. schritte der Proteinbiosynthese von Eukaryoten: Eukaryoten:a) Im Kern-Zelle: DNA wird transkripiert ↓ Primären RNA-Transkript: – nicht-codierende Regionen (*INTRONS) werden vor der Translation entfernt, = (dieser Schritt fehlt in Bakterien, typisch bei Eykaryonten )– woraufhin die EXONS verknüpft werden und die reife mRNA bilden ↓ Reife mRNA ↓ b) Cytoplasma: Reife mRNA wird translatiert ↓ Protein x *Introns tragen keine Information = die nicht codierenden Abschnitt der DNA innerhalb eines Gens, die benachbarte Exons trennen.
Allg. schritte der Proteinbiosynthese von Prokaryoten: Im Cytoplasma: DNA wird transkriptiert ↓ mRNA wird translatiert = – Keine Introns– Mehrere Gene werden gemeinsam in RNA übersetzt: ⇒ Eine einzige mRNA enthält oft mehr als eine codierende Region ↓ Mehrere Proteine – vom kombinierten Transkript werden Proteine abgelesen
DNA vs RNA Unterschiede Lebigkeit, Stabilität:DNA = Langfristig, StabilRNA = Temporal, Kurz Lebig, nicht so stabil Zuckerteil: DNA = Desoxyribose, findet man an C2‘ kein OHRNA = Ribose, findet man an C2‘ eine OH Nukleobasenteil:DNA = Thymin-Base + Desoxyribose ⇒ DesoxythymidineRNA = Uracil-Base + Ribose ⇒ Uridine Strang:DNA = Doppelsträngig: (Ausnahme: einige Viren mit ssDNA) – Komplimentäre Baseenpaar halten so: Thymin=Adenin, Cytosin≡Guanin Wasserstoffbrückenbindung. – Antiparalleler Verlauf: 3'-Ende gegenüber 5'-Ende und umgekehrt RNA = Einzelsträngig (Ausnahme: einige Viren mit dsRNA) Funktion:DNA = Träger der genetischen Information, in jeder Zelle enthalten, RNA = – mRNA (Bote der genetischen Information) – tRNA (Transfer der Aminosäuren bei der Proteinbiosynthese) – rRNA (Bestandteil der Ribosomen-Untereinheiten) – Besonderheit: kann auch an enzymatischen Reaktionen beteiligt sein (enzymatische Funktionen übernehmen)􏰟 z. B. rRNA, tRNA
Was versteht man unter DNA-Replikation bei Prokaryoten und Eukaryoten ? Mechanismus? Semikonservative Replikation: – Die Mutter-DNA bleibt in jedem Tochter-Molekül zur Hälfte enthalten. – Die andere Hälfte wird neu ergänzt. Mechanismus: RNA-Primer (für Einleitung der DNA-Synthese) + Enzym DNA-Polymerase katalysiert: – DNA-Kette Wachsens durch Anbinden von Desoxyribonucleosidtriphosphat am 3‘-Ende der Kette. Das Wachstum verläuft vom 5‘-Phosphat zum 3‘-Hydroxylende. Nach dem Einfügen eines Nucleotids werden die beiden Endphosphate des Triphosphats als Pyrophosphat (PPi) abgespalten. Somit werden beim Anfügen eines einzigen Nucleotids zwei energiereiche Bindungen verbraucht. Durch Hydrolyse von 2Pi wird Energie gewonnen, die genutzt wird, den DNA-Strang anwachsen zu lassen (= Anheftung neuer Einheiten)
Replikation bei Eukaryonten: Bei Eukaryonten: Vorgänge an der DNA-Replikationsgabel:⇒ In der Interphase (die Phase zw. einer Zellteilung) Erbgut einer Zelle muss verdoppelt werden, damit es nach der Teilung in beiden Zellen identisch vorliegt. Das Enzym Helicase spaltet die DNA-Doppelhelix an einer bestimmten Basensequenz Ein Primase katalysiert ein beiden Einzelträngen einen kurzes RNA-Fragment (Primer) Die DNA-Polymerase, die für die jeweilige Synthese des komplementären Einzelstrangs verantworlich ist, braucht diesen Primer, um mit der Synthese zu beginnen. Der 3'–5' Strang wird kontinuerlich in 5'–3' Richtung von DNA Polymerase II synthetisiert Die dafür benötigen Nucleosidt-riphosphate finden im Zellkern Der 5'–3' Strang wird diskontinuerlich synthetisiert:die Synthese bricht etwa alle 1000 Nucleotide ab, da die DNA-Polymerase III nur soweit synthetisieren kann. ⇒ die entstehenden DNA-Fragmente heißen Okazaki-Fragmente Für jeden Wiederbeginn der Synthese eines neuen Fragments, wird ein neuer Primer benötigt. Im Verlauf der Replikation werden diese Primer durch die DNA-Polymerase I aufgefüllt & mittels des Enzyms DNA-Ligase zu einem linearen Strang miteinander verbunden. Enstandene Tochter DNA besteht aus einem elterlichen & einem neuen Strang Bei der Replikation eines eukaryontischen Genom gibt es viele einzelne Replikationsursprünge (ORIs)
Vorgänge der Replikation bei Prokaryonten: DNA von Prokaryonten liegt ringförmig vor = Theta θ Struktur Vorgänge: Bei ringförmiger DNA führt die Bi-direktionale Replikation von EINEM Ursprung zur Bildung von Replikations-Zwischenprodukten, die dem greischischen Buschtaben Theta θ ähneln. Ein wietere Unterschied besteht darin, dass die Replikation im Cytoplasma stattfindet,da Prokaryoten keinen Zellkern haben! Doppelte (2) Replikationsgablen in einem ringörfmigen Chromosom an einem Ursprungsort der Replikation statt, der die bidirektionale Replikation steuert Deshalb muss an beiden Leitsträngen ein Primer gebildet werden, jeder für eine Richting⇒ 2 Replikationsgablen = Typisch für Bakterien (laufen in entgegengesetzte Richtungen)
Was versteht man unter Horizontal Genübertragung bei Bakterien? Horizontal Genübertragung:Übertragung von genetischem Material von einem Organismus in einen bereits existierenden anderen hinein.3 Mechanismus: Transformation Transduktion Konjugation
Was versteht man unter Transformation einer Bakterie? Eins den 3 Mechanismen des genetischen Austausches: Transformation = DNA, die von einer Zell freigesetzt wurde, wird von einer anderen Zelle aufgenommen. Die NICHT virale Aufnahme in KOMPETENTE Bakterienzelle, Pilze, Algen, Hefen, Pflanzen. Kompetenz : Fähigkeit von Zellen frei im Umgebung DNA aufnehmen zu können Aufnahme kann sowohl Einzel-, als auch Doppelstrang Rec A-Protein = Rekombinierendes Protein ;– damit sich die nebeneinander anlagernden DNA-Bereiche homolog sind; → vermittel eine Überkreuzung von DNA-Strängen, die sich sehr ähnlich sind (große Ähnlichkeiten in der Nucleotidsequenz, nicht identisch, sonst würde Rekombination keinen Sinn machen) Mechanismus: Bindung der doppelsträngigen DNA durch ein membrangebundenes DNA-Bindeprotein auf der Bakterien Membran. Eindringen eines der beiden Stränge (ssDNA) in Zelle, während die Nucleaseaktivität den anderen Strang abbaut. Der Einzelstrang in der Zelle wird durch spezifische Proteine gebunden. Die Rekombination mit homologen Regionen des Bakterienchromosoms wird durch das Rec A-Protein vermittel. ⇒ Transformierte Zelle.
Was versteht man unter Transduktion? Transduktion (...durch Phageninjektion): = der Gentransfer zwischen Bakterien durch Viren (Bakteriophagen) Dabei werden Geneübertragen, ohne dass Bakterien Kontakt miteinander haben Lytischer Zyklus: Bakteriophage infiziert eine Wirtszelle (Bakterienzelle) ⇒ injiziert ihre DNA; übernimmt Kontrolle über Zellstoffwechsel a) Normale Phage: Phagen-DNA wird in Kopf der neugebildeten Phage aufgenommen;b) Transduzierte-Partikel: Teil der neugebildeten Phagen ENTHÄLT auch Wirts-DNA in „Kopf“ (nicht infektiös) ⇒ Kopf = Capsid, eine komplexe, regelmäßige Proteinstruktur bei Viren, die der Verpackung des Virusgenoms dient. noch bei b) Transduzierte-Phagen kapseln sich ab & infizieren andere Bakterien-Zellen Bei Wirts-DNA findet homologe Rekombination mit Wirts-DNA neuer Zelle statt; kein lytischer Vorgang 􏰞 ⇒ transduzierte Zelle mit neuer Erb-Info.
Wichtiger Unterschied zw. Transformation & Transduktion Aufnahme freier DNA (Transformation) Aufnahme durch Phagen (Transduktion)
Was versteht man unter Konjugation? Konjugation: (einer der 3 Mechanismus des horizontalen Gentransfers)= die Übertragung von Genmaterial zwischen Einzellern (oder Bakterien), mittel des Pili der Bakterie (F-Pilus) F-Plasmid: (F = Fertilität ; Fertilitätsplasmid) – Ein spezielles Plasmid, welches Bakterien die Fähigkeit zur Konjugation (horizontaler Gentransfer) verleiht.– ermöglicht einen gerichteten Gentransfer vom Spender (F+) zum Empfänger (F-)– F-Plasmid selbst mit hoher Wahrscheinlichkeit auf den Empfänger übertragen. ⇒ Empfänger wird dadurch zu einem Spender – Plasmide können sich selbst ständig replizieren ⇒ Tra-Region (Transfergene) = Gene zur Bildung des sog. F-Pilus & einer DNA-Transferpore. Meschanismus:1. Donorzelle (F+-Zelle) baut Pilus auf; Pilus wird verkürzt, sobald er Kontakt mit der Rezipient (F--Zelle) ausgebaut hat.2. Ein Konjugationsbrücke (ausgehend von der F+-Zelle) verbindet die beiden & das Zellpaar ist stabilisiert.3. Das F-Plasmid wird in einem Strang gespalten & wird von F+-Zelle auf F--Zelle übertrag, wobei die DNA gleichzeitig in F+-Zelle repliziert wird.4. Der Komplementärstrang beginnt in der Rezipientenzelle zu synthetisieren.5. Nach der Vollendung von DNA-Transfer & DNA-Synthese, trennen die Zellen sich ⇒ danach sind beide F+-ZelleBemerkenswert! Es wird immer nur EIN STRANG des Plasmid übertragen (Vorgang wird von Enzyme kontroliert, die in der tra-Region kodiert sind) ) Verlängerung des DNA-Strangs immer von 5' → 3' Plasmidverlust = Kurierung ⇒ Vorteil: Weniger Gen-Material: F--Zellen können schneller replizieren.
Welche Bakterien-Enzyme schneiden/erkennen an bestimmten DNA-Positionen? Restriktionsendonucleasen (REN) = Restriktionsenzyme
Welche Bakterien-Enzyme schneiden/erkennen an bestimmten DNA-Positionen? Restriktionsendonucleasen (REN) = Restriktionsenzyme
Was versteht man unter Restriktionsendonucleasen REN? Funktion? Restriktionsendonucleasen: Restriktionsenzyme sind Bakterien-Enzyme, welche DNA an bestimmten Positionen erkennen/schneiden können. Palindrome = – Spiegelbildliche Sequenz (ist eine Zeichenkette, die vorwärts wie rückwärts gelesen identisch ist)⇒ GAATTC // CTTAAG = typische Erkennungssequenz von RestriktionsenzymenEcoRI: Erkennungssequenz: → Restriktionsschnitt: 5'–GAATTC–3' 5'–G AATTC–3' (Klebrige Ende) 3'–CTTAAG–5' 3'–CTTAA G–5' ↓ Methylierung 5'–GAA(-CH3)TTC–3' 3'–CTTA(-CH3)A G–5'*EcoRI = Restriktionsenzym: die erste Nuklease I aus dem Stamm R von Escherichia coli. dienen als Abwehrmechanismus gegen fremde DNA,um diese kaputt zu schneiden; – Methylierung: Eigene DNA ist mit Methyl maskiert & damit geschützt. → Fremd-DNA hat die Schnittstellen nicht markiert􏰁 damit wird sie zerschnitten – Rehybridisierung kann stattfinden = Basensequenzen zusammenfügen;– Jedoch kann keine kovalente Bindung ausgebildet werden
Wie können eine Ziel-DNA von Fremd-DNA in einen Wirt eingesetzt werden? Fremd-DNA wird von Restriktions-Endonukleasen geschnitten Zusatz eines Vektors, der mit dem gleichen Restriktions-Enzym geschnitten wurde⇒ Restriktions-Endonukleasen können Stelle auf Vektor, wo DNA (Klebrige Enden; oder blunt/glatte Enden) eingesetzt wird, genau bestimmen. Zusatz von DNA-Ligase zur Bildung rekombinanter Moleküle.⇒ Ligase wird dazu genutzt, die Brüche im Doppelstrang zu flicken (Ausbildung von Phosphodiesterbindung); Wiederherstellung der fehlenden kovalenten Bindung. Klonierte DNA (Rekombinante Vektor) in einen Wirt eingeführt
Was muss man tun, um genveränderte Bakterien zu erzeugen? Wie lässt sich eine erfolgreiche Genübertragung nachweisen? Nutzen sie Plasmide, pBR322 als Biespiel. Isolieren & Schneiden: Das Plasmid, pBR322 (Gene für Antibiotika-Resistenz) wird durch das Restriktions-enzym geschnitten, so dass das passende DNA-Fragment im Vektor eingebaut werden kann. Das geht nur, wenn die „klebrigen Enden“ übereinstimmen:⇒ Die Fremd-DNA muss deshalb ebenfalls mit dem gleichen Restriktionsenzym behandelt worden sein. Rekombinieren: Das Einfügen von Fremd-DNA in Plasmide Somit fügt sich nur an einigen Schnittstellen die Fremd-DNA ein, Die Schnittstellen werden durch Ligase "verklebt".⇒ Ein erfolgreicher Einbau macht das Ampicillin-Gen inaktiv.⇒ Kein Einbau, dann bleibt das Ampicillin-Gen funktionsfähig. Transformieren: Die neu kombinierte DNA wird durch Transformation in die Zelle der Bakterien eingeschleust. Nur bei etwa 1 von 100 000 Bakterien-Zellen den Vektor aufgenommen.⇒ Dabei handelt es sich um rekombinierte & nicht rekombinierte Plasmidringe. Selektieren: Die Selektion hat das Ziel, diejenigen Zellen auszulesen, die die rekombinierten Plasmide enthalten. Bakterien, die das nicht-rekombinierte Plasmid aufgenommen haben = sind resistent gegenüber Ampicillin & Tetracyclin: ⇒ können somit auf mit diesen Antibiotika angereicherten Nährboden wachsen. Bakterien mit rekombiniertem-Plasmid:⇒ können nur auf mit Tetracyclin angereicherten Nährboden wachsen. Im ersten Schritt wird überprüft, welche Zellen überhaupt das Plasmid aufgenommen haben.= Zellen ohne Plasmid können auf einem mit Tetracyclin angereicherten Nährmedium nicht überleben.⇒ Auf dem Nährboden mit Tetracyclin haben alle tretracylin-resistenten Bakterien Kolonien gebildet. Nimmt man nun einen Samtstempel & überträgt das Muster auf eine Nährkultur mit Ampicillin, dann ⇒ überleben alle Bakterien, die keine Fremd-DNA enthalten.⇒ sterben alle Bakterien, die Fremd-DNA enthaltenIndem man nun die beiden Muster der Kulturen miteinander vergleicht, kann man die Kolonien mit Fremd-DNA identifizieren.
Identifizierung von Mikroorganismen (Nachweisverfahren): Aussehen Mikroskopische Verfahren:Mit der Licht Mikroskopie (Phasenkontrastmikroskopie) lassen sich 1. Zellformen, 2. charakteristische Aggregate sowie 3. Zellanhängsel & Einschlüsse sichtbar machen. So kann man das Vorhandensein 4. einer oder mehrere Flagellen & die 5. Art ihre Inserierung zur Entscheidung genutzt werden, genauso wir das 6. Auftreten von Dauerformen (Sporen). Die 7. Gram-Färbung erlaubt eine erste Entscheidung 7. nach Zellwandtyp. 1) Morphologie:http://www.spektrum.de/lexika/images/bio/fff644.jpg Staphylococcus: Coccus = kugelförmige Zelle (gram+)z. B Staphylococcis aureus = häufig in Haufen (Traubenform) angeordnet ist 􏰂 Bacillus = Stäbchen (gram+)z. B. Bacillus cereus = sporenbildend (hellen Pünktchen) Eschericia coli = gerader, zylindrischer Stäbchen mit runden Enden (gram-) Saccharomyces cerevisiae = rund bis oval, Knospung = kann auch in der Hyphenform vorliegen, Eukary. = Zellkern! Camylobacter: Korkenzieherförmige spirillen 2) Subzellulare Strukturen:3) Gram-Färbung : Sie ermöglicht es, Bakterien in zwei große Gruppen, die sich im Aufbau ihrer Zellwände unterscheiden, einzuteilen: grampositive gramnegative 3 Stufen: Färben, Entfärben, Gegenfärben Phase: Färben1) Färbung aller Bakterien mit einem basischen Karbol-Gentianaviolett (Kristallviolett) 2) Nachbehandlung mit Lugolscher Lösung (Iod-Kaliumiodid-Komplex): ⇒ wird ein Farbstoff-Iod-Komplex in den Bakterien gebildet ⇒ Die Bakterien scheinen dunkelblau. Dieser Farbkomplex ist wasserunlöslich aber in Ethanol ist er hingegen löslich daher... Phase: Entfärben/Auswachung: (entscheiden) hier verhalten sich Gram+ & Gram--Bakterien verschiedend3) Behandlung mit 96% Ethanol: ⇒ Aus gramnegativen Bakterien: Farbkomplex wird extrahiert ⇒ Aus grampositiven Bakterien wird Farbkomplex dagegen wegen der dickeren Mureinschicht nicht extrahiert. Phase: Gegenfärben4) Zur Darstellung der gramnegativen Bakterien: – verdünnter Fuchsinlösung = rot erscheinen oder – Safraninlösung = rotorange erscheinen
Ursachen des unterschiedlichen Färbungsverhaltens gram+ & gram-Bakterien. Beispiele von gram+ & gram-Bakterien. Grampositive Bakterien: besitzen eine der Membran aufgelagerte dicke, mehrschichtige „Mureinhülle (Peptidoglykane) In den Zwischenräumen der Mureinhülle sammelt sich die Lugolsche Lösung an. Hier wirkt der Alkohol dehydratisierend & verringert den Abstand zwischen den Molekülen, so dass die Farbstoff-Komplexe nicht vom Alkohol ausgewaschen werden können.⇒ Somit bleibt die dunkelblaue Färbung.z. B Streptococcus, Staphylococcus, Bacillus, Clostridium, Lactobacillus, Gramnegative Bakterien: hingegen besitzen nur eine dünne Mureinhülle, der zusätzlich eine zweite Lipid-Membran (LPS) aufgelagert ist. Der Alkohol wirkt hier lipid-lösend, sodass die dünne Mureinhülle freigelegt wird. Die Farbstoff-Komplexe werden vom Alkohol ausgewaschen⇒ das Bakterium wird entfärbt.
Wie wird Enterobakterien von anderen Gram-negativen Keimen wie z.B. Pseudomonaden oder Aeromonaden abgegrenzt werden? Oxidase Test is used to identify bacteria: that produce cytochrome c oxidase, an enzyme of the bacterial electron transport chain. (note: - All bacteria that are oxidase positive are aerobic, & can use oxygen as a terminal electron acceptor in respiration. This does NOT mean that they are strict aerobes. - Bacteria that are oxidase-negative may be anaerobic, aerobic, or facultative; the oxidase negative result just means that these organisms do not have the cytochrome c oxidase but may respire using other oxidases in electron transport.) Der Oxidase-Test ist ein Verfahren zum Nachweis des Enzyms Cytochrom c Oxidase in der Atmungskette von Zellen (zur Klassifikation von Bakterien) Cytochrom c wird durch Oxidase-Reagenz in Cytochrom c Oxidase reduziert. Dabei wird das farblose Reagenz (TMPD) zu einem intensiv gefärbten Radikal-Kation (Würster Kation) oxidiert.⇒ Pseudomonas = Oxidase-positiv⇒ Enterbacteriaceae = Oxidase-negativ (haben keine Cytochrom c Oxidase)
Welche Labortechnische Methode wird zur Identifizierung Bakterien anhand verschiedener Merkmale angewendet? Physiologischer Test „Bunte Reihe“: handelt es sich um eine labortechnische Methode zur Bestimmung (Identifizierung) Bakterien anhand verschiedener Merkmale. Dabei wird auf bestimmte Enzymaktivitäten, den Abbau von Substraten, die Bildung von Stoffwechselprodukten & bestimmte Fähigkeiten geprüft. Aufbau: Die Bunte Reihe besteht aus Reagenzröhrchen, die mit verschiedenen Nährmedien beschickt sind. Die Nährmedien enthalten Reagenzien & Indikatoren zum Nachweis von bestimmten Eigenschaften, die eine Bestimmung von Bakterienarten ermöglichen. Beimpft werden die Röhrchen mit einer Reinkultur des zu bestimmenden Bakteriums. Die Ergebnisse (positiv/negativ) werden mit einer Tabelle vergleichen & So kann man mit einer bestimmten Wahrscheinlichkeit den Bakterienstamm einer Spezies zuordnen.
Was versteht man unter Kleine bunte Reihe? Kleine bunte Reihe: Älteste & kompakteste Version labortechnischer Methode, um Bakterien (v. a DARMBAKTERIEN) zu identifizieren! Sie enthält: 1) Kligler-Agar: 2) Harnstoff-Agar, 3) MIO-Röhrchen und 4) Simmons Citrat-Agar. Die Nährmedien werden je nach Art des Mediums verschieden beimpft. Kligler-Agar: – zur Identifizierung gram(–) Enterobacteriaceae– Nachweis von: (1) Laktase = Lactose-Abbaus (2) Gärung = Verwertbarkeit der vorhandenen Kohlenhydrate (erkennbar durch CO2-Bildung), (3) H2S-Bildung.– häufig der TSI-Agar (triple sugar iron agar, Dreizucker-Eisen-Agar) verwendet Harnstoff-Agar: – Nachweis von Urease = hydrolysieren Harnstoff 􏰁→ CO2 + 2NH3; ⇒ pH steigt = pH-Indikator-Phenolrot = 6,4 gelb nach 8,2 rotviolett; 􏰂 ⇒ Rotfärbung = Organismus kann Harnstoff spalten Simmons Citrat-Agar:– Fähigkeit Citrat als EINZIEGE Energiequelle zu wachsen; z. B Enterobacteriaceae, & einige Pilze = Positiv: pH steigt = pH-Indikator Bromthymolblau = grün nach blau MIO-Röhrchen:– lassen sich Bakterien aus der Familie der Enterobacteriaceae weiter voneinander unterscheiden.– 3 Merkmalen, die man mit diesem Medium nachweisen kann: (1) aktive Beweglichkeit (Motilität) – Aktive Bewegung wird bei Bakterien der Enterobacteriaceae durch Flagellen verursacht. (2) Bildung von Indol aus Tryptophan durch das Enzym Tryptophanase. (3) Bildung von Putrescin aus Ornithin durch das Enzym Ornithindecarboxylase (ODC).
Was versteht man unter Chemotaxonomie? Chemotaxonomie = die Analyse der chemischen Bestandteile von Zellwänden Wenn man sich die Fettzellen in Zellmembran anschaut & vergleicht: = Bakterien sind hier sehr viel diverser als bei Eukaryonten Taxonomisches Klassifizierendes Merkmal der Bakterien = Profil der Zellmembran (􏰁Identifizierung) ⇒ Tabelle über FS-Profil einzelner Bakterienstämme z. B. Werden 3-Hydroxy-FS nachgewiesen (diese sind nur in äußerer Membran : nur gram-negative haben diese) MIDI-System = 􏰁Fettsäureanalyse:– Fettsäuren in den Zellmembran werden als Merkmal zur Identifizierung benutzt: 1. Verseifung (Saponification) + Methylierung → 􏰁Fettsäure + Methylgruppe (= Fettsäuremethylester: bessere Löslichkeit) 2. Extraktion 3. Analyse durch Flammenionisationsdetektor (FID) • 􏰂 Beschriftung der Peaks & Profil-Vergleich mit Datenbank • Benennung der FS
Wie werden Bakterien molekularbiologische nachgewiesen? Im welchen Bereich werden die (in Bezug auf Lebensmittelinfektionen) eingesetzt? Warum werden die bevorzugt? Die Molekularbiologie befasst sich mit der Struktur, Biosynthese & Funktion von Desoxyribonukleinsäure (DNS) & Ribonukleinsäure (RNS) auf molekularer Ebene. Innerhalb der medizinischen Mikrobiologie:⇒ Nachweis von Viren, Bakterien & Pilzen (Infektion) Darüber hinaus zur Bestimmung bestimmter Resistenzen & zur Abklärung von Infektketten (Typisierung, „Fingerprinting“) eingesetzt. Warum molekularbiologische Nachweise?– sehr kurze Analysezeit – schnelle Verfügbarkeit– schnelle Typisierung bei Infektionsketten ist möglich – spezifischer Nachweis von Virulenzgenen– gezielte Nachweis von entscheidenden Pathogenitätsfaktoren (z.B. Toxine, Oberflächenantigene) Methode: Polymerase Kettenreaktion (PCR) Real-Time-quantitative-PCR rRNA-gerichtete Oligonukleotidsonden (FISH)
Was versteht man unter Polymerase Kettenreaktion (PCR)? Die Erkennung von Erbkrankheiten in einem vorliegenden Genom ist ein langwieriger & komplizierter Vorgang, der durch den Einsatz von PCR bedeutend verkürzt werden kann. Das entsprechendes Gen kann durch PCR in vitro mit den geeigneten Primern amplifiziert & sequenziert werden (Sequenz der Nukleotide der DNA zu bestimmen), um Mutationen aufzuspüren.PCR ermöglicht ebenfalls die Erkennung von Virale Erkrankungen früh (kann sofort nach der Infektion erfolgen), indem die RNA erst in DNA umschreibt werden muss und dann mittels PCR vervielfältigt werden Nachteil: Nur nachweis von DNA, keine lebende Zellen. Verfahren: Die gesamte Nukleinsäure (DNS oder RNS aus Patientenmaterial & vorhandenen Erregern) aus Blut oder anderen Proben gewonnen. Reaktionslösung bestehend aus:a) Primern („Starter“), welche für den gesuchten Erreger charakteristisch sind, b) Basenc) Enzym Polymerase In der Reaktionslösung wird der gesuchte Krankheitserreger(falls vorhanden) detektiert &so vermehrt, dass er mit verschiedenen Methoden nachgewiesen werden kann.
Was versteht man unter Real-Time-quantitative-PCR? Real-Time-quantitative-PCR : ist eine Vervielfältigungsmethode für Nukleinsäuren, die auf dem Prinzip der PCR beruht, & zusätzlich die Quantifizierung der gewonnenen DNA ermöglicht. Die Quantifizierung wird mit Hilfe von Fluoreszenz-Messungen durchgeführt, die während eines PCR-Zyklus in Echtzeit (Real Time) erfasst werden. Die Fluoreszenz nimmt proportional mit der Menge der PCR-Produkte zu. Am Ende eines Laufs wird anhand von erhaltenen Fluoreszenzsignalen die Quantifizierung in der exponentiellen Phase der PCR vorgenommen. Nachweis des PCR-Produktes durch Agarose-Gelelektrophorese mit Ethidiumbromid (fluoresziert)
Was versteht man unter rRNA-gerichtete Oligonukleotidsonden (FISH)? rRNA-gerichtete Oligonukleotidsonden (FISH = Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung) In-situ-Hybridisierung (ISH) = molekularbiologische Nachweis von Nukleinsäuren (RNA, DNA) → in Geweben, einzelnen Zellen oder auf Metaphase-Chromosomen. Dabei wird eine künstlich hergestellte Sonde probe aus einer Nukleinsäure eingesetzt, die über Basenpaarungen an die nachzuweisende Nukleinsäure bindet (Hybridisierung).⇒ Sonden-DNA + Ziel-DNA werden zu Einzelsträngen aufgeschmolzen. = Paarung von komplementären Basen Sonde-DNA- & Ziel-DNA-Einzelsträngen. Bei der Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) wird die Sonde mit Hilfe eines fluoreszierenden Farbstoffes nachgewiesen⇒ ermöglicht den gleichzeitigen Nachweis mehrerer Strukturen durch den Einsatz verschiedener Fluoreszenzfarbstoffe, z. B. Nachweis eines Chromosoms mit zwei darauf liegenden Genen Phylogenetische Stammesgeschichte Farbstoffe = markierte Sonde = z. B. Oligonukleotid + Cy3 (Fluoreszenz-Farbstoff Cyanin), die in ihrer Basensequenz zu konservierten Sequenzen der 16S-rRNA (Prokaryoten) komplementär bindet. ⇒ leuchten unter Fluoreszenz-Mikroskop
Allg. Schritte zur PCR bzw. rPCR Verfahren 95 °C = Aufschmelzen der Ziel DNA (trennung der Doppenstränge durch Erhitzen) 40 - 60°C = Anlagerung: Spez. Primer für beide Einzel-Stränge der Ziel DNA im überschuss & dNTPs gegeben 72 °C = Polymerisation mit Taq-Polymerase 95 °C Aufschmelzen des neuen Doppelstranges DNA .. sich wiederholt...
Häufigste Erreger von Lebensmittelinfektionen: Salmonella spp. 1. Salmonella spp. am meisten verbreiteten bakteriellen Enteritiserreger (Intestinal pathogens) Risikogruppen (Kinder, ältere Menschen und immunsupprimierte Patienten) Infektionen verursachenden Lebensmittel: – Geflügelfleisch – rohe Eier (Speisen, die Rohei enthalten) – rohes, bzw. nicht durchgegartes Fleisch– Wurstprodukte– Gewürze oder Schokolade. infizierte Lebensmitteln sollten daher durcherhitzt werden, da Salmonellen durch Hitze abgetötet werden können. (≥65 °C) Sie können in sehr sauren oder salzhaltigen Lebensmitteln nicht vermehren, aber überleben. Im Sommer wo die Hitze ideale Voraussetzung für eine schnelle Vermehrung ist. Die berühmte "Sommer Grippe" ist meistens eine Salmonelleninfektion. Sie vermehren sich in kurze Zeit & verursachen eine Infektion zumeist durch ihre große Zahl.→ Man sollte daher Lebensmittel schnell & frisch verarbeiten und nicht lange stehen lassen. Durch Nachweis PCR: wird ein Fragment aus dem invA-Gen herangezogen:→ Das Genprodukt der inv-Gene (invA, B, C, D) erlaubt Salmonella in die Darmepithelzellen einzudringen.
Häufigste Erreger von Lebensmittelinfektionen: Thermophilen Campylobacter coli & Campylobacter jejuni: häufigsten bakteriellen Erreger von Durchfall-Erkrankungen in DE sind mikroaerophile Keime, die bei 42°C wachsen. hauptsächlichen Erregerreservoire sind zahlreiche warmblütige Wild-, Nutz- und Heimtiere (Vögel und Säugetiere), ohne dass diese klinische Symptome einer Erkrankung zeigen. Hauptinfektionsquellen: – Nicht ausreichend erhitztes Geflügelfleisch und Geflügelprodukte– Rohmilch oder Rohmilchprodukte– Nicht durchgegartes Hackfleisch– Frische Rohwurstsorten wie Mettwurst– Verunreinigtes Trinkwasser, nicht gechlortes. Allerdings können sich Campylobacter-Keime nicht in den Lebensmitteln vermehren. → Das heißt: Die Menge der Erreger bleibt konstant, auch wenn das Fleisch oder die Milch länger in der Sonne stehen.→ besitzen dort aber eine relativ hohe Überlebensfähigkeit.
Häufigste Erreger von Lebensmittelinfektionen: Bacillus cereus: bei unsachgemäßer Aufbewahrung von Lebensmitteln ein bestimmtes Gift (Toxin) bilden Häufig befällt er Lebensmittel wie gekochten Reis, gekochtes Fleisch, Gemüse & stärkehaltige Erzeugnisse (z. B. Pudding). Toxin lösen bei Menschen Durchfall, Erbrechen und Tenesmen (Stuhldrang) aus. Ursachen & Vergiftung: 1) Da die Bacillus cereus Sporen (inaktiver Zustand der Bakterien) hitzeresistent sind, überstehen sie den Kochvorgang.2) Wenn nun eine mit diesen Bakterien kontaminierte(verunreinigte) Speise warm gehalten oder langsam abgekühlt wird, können sich die Sporen weiter vermehren & dabei ein hitzestabiles Neurotoxin bilden3) Nach dem Verzehr der befallenen Speisen vermehrt des Keimes im Darm & es ensteht ein weiteres, diesmal auf den Verdauungskanal wirkendes Gift (Enterotoxin) 4) Enterotoxin führt zu Bauchschmerzen & wässerigem Durchfall. Ein Auskeimen der Sporen kann durch eine schnelle Kühllagerung der erhitzten Speisen verhindert werden. Deshalb muss das Hauptaugenmerk auf die Einhaltung der Kühlkette gelegt werden. Wächst in einem Bereich mit einem Temperaturoptimum zwischen 30 - 40°C.
Häufigste Erreger von Lebensmittelinfektionen: Staphylococcus aureus: der Nasen-Rachen-Raum & die Haut bei gesunden Menschen & Tieren sehr häufig kontaminiert. Bei unsachgemäßer Aufbewahrung oder nicht ausreichend erhitztes Lebensmitteln Bilden Superantigens = Enterotoxine (SE) & Enterotoxin-ähnliche SAgs (SE-like) Bereits äußerst geringe Toxinmengen können Vergiftung (Erbrechen, Übelkeit, Durchfall & Kreislaufsymptome) ausreichen. Häufig findet man dass Bakterien auf eiweißreichen Nahrungsmitteln wie Milchprodukte, Speiseeis, Konditoreiwaren. Mensch die primäre Quelle für eine Kontamination:– Eine Infektion kommt durch den Mitmenschen, der durch Niesen oder durch offene Wunde von Staphylokokken auf das Lebensmittels überträgt.(Salmonellen sind dagegen mehr die Lebensmittel selbst infiziert.) Das Erhitzen von Lebensmitteln scheidet zur Abtötung der Erreger aus aber das gebildete Gift hitzestabil kann nicht durch Erhitzen von Lebensmitteln zerstört werden. Methi-cillin-resistente Staphylococcus aureus ("multiresistenter SA") gelten heute als der Hauptverursacher von Infektionen in Krankenhäusern mit tödlichem Ausgang.

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Mikrobiologie (Fach) / Pilze, Viren, Genetik bei Prokaryoten (Lektion)