Biologie der Zellen und Gewebe (Fach) / Zytoskelett (Lektion)

Mikrotubuli, Mikrofilamente, Intermediärfilamente

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• Mikrofilamente Actin als Hauptbestandteil; ∅5-7nm Mikrofilamente findet man im Cytoplasma aller eukaryotischen Zellen in großen Mengen. Von den primitivsten einzelligen Eukaryoten bis zum Menschen haben alle Mikrofilamente die gleiche molekulare Organisation.  Sie selbst sind hochdynamische Strukturen, die an vielfältigen Bewegungsvorgängen beteiligt sind. z. B.: – Cytokinese – Muskelbewegung – Plasmaströmung
• Intermediärfilamente Ø 10nm
• Mikrotubuli röhrenförmig, Tubuline als Hauptbestandteil; Ø24nm MT findet man im Cytoplasma aller eukaryontischen Zellen Von den primitivsten einzelligen Eukaryonten bis zum Menschen haben alle MT die gleiche molekulare Organisation.  Sie selbst sind hochdynamische Strukturen, die an vielfältigen Bewegungsvorgängen beteiligt sind:               – Geißelbewegung               – Vesikeltransport (ER  Golgi ...)               – Chromosomenbewegung  sind ein Bestandteil des Cytoplasmas aller eukaryotischer Zellen – mit einer Ausnahme; welche?  Größe – Dimension in der Zelle: z.B. in Fibroblasten ~ 1.000 mm2 Oberfläche! (entspricht etwa der Größe der Cytoplasmamembran, 10 x mehr wie die Kernhülle!)
• Strukturen, die aus den Proteinen des Zyteskeletts aufgebaut sind Haare Mitosespindeln Myofibrillen Cilien
• Zytoskelettproteine sind verantwortlich für: • Bewegung in Zellen:  – Transport von Organellen – axonaler  Transport – Plasmaströmung – Cytokinese – Chromosomentransport • Bewegung von Zellen: – amöboide Bewegung – Zellwanderung im Embryo – Wundheilung – Cilienschlag – Chemotaxis
• Aufbau(Mikrotubuli) im elektronenmikroskopischen Bild erscheinen die MT als Röhrchen; Durchmesser 25 nm; Wandstärke 5 nm entweder einfache Röhren 13 Längsreihen um einen Hohlraum herum = Protofilamente (~ 13-adriges Kabel!) ⇒ frei im Cytoplasma oder doppelte Röhrchen ⇒ in Cilien oder dreifache Röhrchen ⇒ Centriolen
• chemischer Aufbau (Mikrotubuli) Proteine mit Namen Tubulin: kleine, globuläre Proteine, 4 - 5 nm  ca. 50 kDa, also ca. 450 Aminosäuren lang es gibt zwei sehr ähnliche Varianten (= Isoformen) des Tubulins: a-Tubulin + b-Tubulin ein a-Tubulin und ein b-Tubulin bilden ein Dimer diese Tubulin Dimere lagern sich zu langen Filamenten zusammen
• Molekulare Struktur - Filamentstruktur (Mikrotubuli) Monomere:  ellipsoid  46 x 40 x 65 Å  (B x H x T)  3 Domänen: N-terminal: Nucleotid-bindend                                                                           Mittelteil: große Loops                                                                                                 C-terminal: a-Helices  a und b Untereinheiten sind sehr ähnlich   Dimere: 46 x 80 x 65 Å Loops der Mittelteile zeigen zum Lumen.  Helices liegen an der Außenseite. (Protease-sensitiv, zugänglich für Antikörper, Bindung von MAPs)  2 Grenzen im Protofilament: 1. im Dimer 2. zwischen benachbarten Dimeren Anordnung der Dimere: Nucleotid-Bindungsstelle des b-Tubulins zeigt zum + Ende der MT; a-Tubulin zeigt zum – Ende. Taxol bindet an der Kontaktzone benachbarter Protofilamente.
• Anordnung der Dimäre im Filament immer gleich: an einem Ende des Filaments nur a-Tubuline, am anderen Ende nur b-Tubuline! Polarität, zwei unterschiedliche Enden! das Wachstum ist an diesen Enden unterschiedlich schnell! + Ende: schneller Aufbau, aber auch schneller Abbau – Ende: langsamer Auf- und Abbau = dynamische Instabilität !
• Tubuline binden GTP(Mikrotubuli) a-Tubulin: 1 x GTP, nicht austauschbar! b-Tubulin: 1 x GTP, austauschbar                  wird bei der Assembly der Mikrotubuli hydrolysiert 
• Wachstum/Schrumpfen der Mikrotubuli Wachsende und schrumpfende Enden sehen unterschiedlich aus!  Wachstum: lange, gebogene, flache Strukturen (“sheets”), die sich allmählich zu Röhren schließen.  Verkürzung: Protofilamente dissoziieren als Ringe, danach weitere Dissoziation zu Dimeren.
• dynamische Instabilität(Mikrotubuli) GTP ist notwendig Ca2+ nur in niedrigen Konzentrationen!  langsame Bildung eines “Primers” schnell (+) und langsam (-) wachsendes Ende Kritische Konzentration GTP-Hydrolyse / + Ende mit GTP-Tubulin
• Mikrotubuligifte Mitose Hemmer (Anwendung bei Tumor-Therapie) Herbstzeitlose: Colchizin Eibe:Taxol
• Intrazelluläre Verteilung von Mikrotubuli Experiment: Behandlung von Zellen mit einer Substanz, die Mikrotubuli zerstört Absetzen der Substanz → MT bilden sich neu  Aber: dies geschieht nicht zufällig, sondern von einem bestimmten Punkt aus, dem "Organisationszentrum" (MTOC, Centrosom)  Polarität der MT:   - Ende am MTOC   + Ende zeigt davon weg(nahe der Plasmamembran)
• Centriolen (MTOC bei tierischen Zellen) 9 Dreifachtubuli, im Kreis angeordnet, bilden einen kurzen Zylinder  ein zweiter, fast identischer Zylinder steht im rechten Winkel dazu die Centriolen werden während der S-Phase verdoppelt Zellen in der G1-Phase haben nur ein MTOC, in der G2-Phase zwei.
• Transport an Mikrotubuli Viele Substanzen und Organellen müssen in der Zelle oft über größere Distanzen transportiert werden. Bsp.: axonaler Transport, schneller und gerichteter Transport von Vesikeln
• Axonaler Transport Ribosomen befinden sich nur im Zellkörper von Neuronen. In den Axonen und Synapsen findet keine Proteinsynthese statt! Alle Proteine müssen entlang des Axons zu den Synapsen transportiert werden!!!
• Entwicklung des ersten künstlichen Systems, in dem MT-Bewegung gezeigt wurde: Riesenaxone von Tintenfischen: Axone präparieren Cytoplasma ausquetschen Frage: Was wird benötigt, damit sich Vesikel an Mikrotubuli entlang bewegen können? =>Motorpeoteine
• Motorproteine(Mikrotubuli) 1. Kinesine:  Proteinkomplexe, die ihre Fracht in Richtung + Ende der MT transportieren´  = anterograder Motor 2. Dyneine: Proteinkomplexe, die in Richtung – Ende transportieren (= retrograder Motor)
• Cilien, Flagellen, Geißeln (MIkrotubuli) haarförmige Gebilde an der Zellmembran, die auf Bewegung spezialisiert sind (in Flimmerepithelien, Spermien, einzelligen Algen,Ciliaten, ...) Komplex aus MT und assoziierten Proteinen, genannt Axonem
• Bau von Cilien Jedes Axonem besteht aus: 2 zentralen, einzelnen Mikrotubuli, 9 äußeren Paaren von Mikrotubuli. = 9x2 + 2 Struktur An der Basis der Cilien befindet sich ein MTOC mit Ähnlichkeit zu Centriolen (Basalkörperchen). Die Bewegung entsteht durch Wechselwirkung der Dynein-Arme mit den benachbarten Mikrotubuli (analog zur Wechselwirkung der dicken und dünnen Filamente im Muskel)
• essentiell für Cilienschlag: Nexin-Brücken Durch diese Querbrücken wird die Gleitbewegung der Doublets in Krümmung umgesetzt
• Aufbau der Mikrofilamente im elektronenmikroskopischen Bild erscheinen sie als lange Fäden; Durchmesser 5 - 7 nm Grundlage ist ein Protein mit Namen Actin: • kleines, globuläres Protein, 4 - 5 nm   ca. 42 kDa, also ca. 375 Aminosäuren lang es gibt mehrere, sehr ähnliche Isoformen (= Varianten) des Actins viele Actin-Untereinheiten (Monomere, G-Actin) polymerisieren zu langen, fadenförmigen Aggregaten (F-Actin) es gibt eine Reihe Actin-bindender Proteine, die die Eigenschaften des Actins beeinflussen
• Polymerisation (Mikrofilamente) Polymerization G (globuläres) Actin ---<--------> F (filamentöses) Actin [Monomer]                                  [Polymer]                                                                                   nicht-kovalente Verbindung! Induzierbar durch 1 mM MgCl2, 100 mM KCl, ... Polymerisation kann experimentell verfolgt werden           - low / high shear viscosity           - Sedimentation (low speed / high speed)           - UV Absorption           - Fluoreszenz Spektroskopie (höhere Fluoreszenz von Pyren-F/A) Monomeres G-Actin=>(langsam)1.Bildung eines "polymerization nucleus"=>2. Elongation(Addition von Monomeren an beiden Enden der Nuclei)
• Anordnung der Monomere im Filament (Mikrofilamente) immer gleich: • Polarität des Filaments mit zwei unterschiedlichen Enden! • das Wachstum ist an diesen Enden unterschiedlich schnell! + Ende: schneller Aufbau – Ende: langsamer Aufbau
• ATP&Kinetik der Polymerization (Mikrofilamente) kurz nach der Polymerisation wird ATP zu ADP hydrolysiert (Pi dissoziiert langsam)  Unterhalb einer Mindestkonzentration an freiem G-Actin stoppt die Polymerisation = kritische Konzentration! (kritische Konzentration höher für ADP-Actin!)
• Actin:Polimerisation (Arrowhead Komplexe) Myosinköpfchen binden nur in einer Richtung an das F-Actin.                      ⇒"arrowhead komplexe"                   ⇒ Visualisierung der Filament-Polarität "pointed end - barbed end" arrowhead komplexe wirken als Polimerisations-Nuclei                         ⇒pointed end=slow growing end                   ⇒barbed end=fast growing end                                            
• Drogen, die auf Actin wirken Cytochalasin D Alkaloid isoliert aus dem Pilz Zygosporium mansonii. Bindet an das barbed (+) end von Actin Filamenten. ⇒ induziert Filament Depolymerisation Phalloidin Toxin aus dem giftigen Pilz Amanita phalloides. Bindet entlang von Actin Filamenten.    ⇒verhindert Filament Disassembly                  G-Aktin  --Phallodin--> F-Aktin --Cytochalasin D--> G-Aktin
• Actin-bindende Proteine (Mikrofilamente) Scheinbarer Widerspruch im Experiment:                                                                                         -unter Bedingungen wie sie in der Zelle herrschen, findet man in vitro fast nur F-Actin   -trotzdem gibt es in Extrakten von Zellen eine größere Menge nicht polymerisierten Actins!? Erklärung: Man fand Proteine, die an G-Actin binden und das Monomer in der Zelle stabilisieren! ⇒Identifikation der ersten Actin-bindenden Proteine • regulieren die Organisation von Actin auf unterschiedliche Art und Weise • nach der Primärsequenz kann man heute > 48 unterschiedliche Klassen Actin-bindender Proteine unterscheiden! • es bewährt sich eine Einteilung der Proteine nach ihrer grundlegenden Funktion
• Probleme in der Zelle(Mikrofilamente): • lokalisierte Induktion der Polymerisation • lokal unterschiedliche Strukturierung • Längenregulation - Stabilisierung    Mikrofilamente    ....
• Mikrovilli sind fadenförmige Zellfortsätze, die zur Oberflächenvergrößerung von Zellen und der Verbesserung des Stoffaustausches dienen. Mikrovilli sind hauptsächlich in (tierischen) Epithelzellen (z. B. im Darm, Niere, Geschmacksknospen, Gebärmutter, Eizellen) vorhanden und formen den für diese Epithelien typischen Bürstensaum. Die fingerförmigen Mikrovilli sind ca. 0,1 µm dick und je nach Zellart bis zu 2 µm lang. Jeder Mikrovillus enthält ein zentrales Bündel aus Aktinfilamenten Zur seitlichen Oberfläche wird das Aktinbündel durch Myosin-I und zum Zytoskelett nach basal durch Spektrin verbunden. Jeder Mikrovillus trägt am apikalen Ende eine amorphe Kappenregion.
• Subzelluläre Organisation der Mikrofilamente Stressfasern: antiparallele Bündel (kontraktil) Cortex: Netzwerke Filopodien: parallele Bündel
• Grundlage für Bewegungsvorgänge • Interaktion der dünnen Myofilamente mit den dicken Myofilamenten • Regulation der Interaktion durch Ca2+, Tropomyosin, Troponin-Komplex, Kinasen, ... • räumliche Integration und Organisation der Filamente • Längenregulation der Filamente
• Dünne Myofilament - Mikrofilamente - Tropomyosin: deckt Myosin-Bindungsstellen ab - Troponin: reguliert Bindungsort des Tropomyosins (T=Tropomyosin-Bindung, C=Calcium-Bindung, I=Inhibition)
• Aufbau Myosin II Kopf-Domäne: - globulär - ATPase - Filament-Bindung Stab-Domäne: - a-helical - Dimerisierung - Polymerisierung
• Dicke Filamente - Myosin-Filamente -ca 250 Myosin II Moleküle -bipolar
• Querbrückenzyklus(Muskelkontraktion) 1) Anlagerung von ATP an Myosinköpfe der Myosinfilamente führt zur Lösung der vorher geknüpften Querbrücke(Actin-Myosin-Bindung)2)Während Hydrolyse von ATP zum intermediären ADP-Pi_myosin-Komplex klappt der Myosinkopf in die Ausgangsstellung zurück3) Nach freisetzng von Calcium aus dem sarkoplasmatischen Retikulum bindet sich Calcium an den troponinkomplex des Actinfilamentes. Calciumbesetzung des Troponins bewirkt, dass sich das Tropomyosin in die Furche zwischen den beiden Actinsträngen verlagert. Änderung ermöglicht Anheftung der Myosinköpfe an Actinfilamente--> Myosinschaft wird gedehnt4)Zuerst wird Pi, dann ADP freigesetzt. Der Myosinkopf kippt nach Pi-Freisetzung unter Konformationsänderung in die 45° Stellung. Dieser krafterzeugende "ruderschlag" ist der geschwindigkeitsbestimmende Schritt im Zyklus.

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