Biotech I (Fach) / Proteinbiotechnologie (Lektion)
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- Welche besonderen Eigenschaften haben die E. coli-Stämme Rosetta und Origami? Origami: Durch Mutationen der gene für Thioredoxin-Reduktase und Glutathion-Reduktase ist die Bildung von Disulidbrücken im Cytoplasma stark erhöht. Rosetta: bessere Expression eukaryotischer Proteine, die Codons enthalten, die in E.coli kaum genutzt werden. Stellt tRNAs für 6 zusätzliche Codons bereit.
- Wie kann die Bildung von inclusion bodies in E. coli vermieden werden? - Reduktion der Proteinsynthese (niedrigere Temperatur, schwächerer Promotor, Induktion bei hoher Zelldichte) - Renaturierung der isolierten Zielproteine - Änderungen des Kulturmediums: mehr Puffer, Minimalmedium, Ethanol (3%) oder Hitzeschock für Überexpression von Chaperonen, 0,5 M Saccharose führt zur Akkumulation von Osmoprotektoren - Fusions-Tag, der die Löslichkeit verbessert (NusA) - Nutzung spezieller Stämme (Origami)
- Welche Vorteile und welche Nachteile hat die Sekretion des (rekombinanten) Zielproteins gegenüber einer intrazellulären Expression für die Proteinaufreinigung? +: Weniger Proteolyse, einfachere Aufreinigung da weniger unerwünschte Proteine vorhanden sind, besseres Faltungsverhalten, authentischer N-Terminus -: Sekretion nicht üblich -> mehr Aufwand, niedrige Proteinkonzentration -> Konzentrierung erforderlich
- Was bedeutet die Abkürzung SDS-PAGE? Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gelelectrophoresis
- Welche Informationen können Sie aus einer Gelelektrophorese (nativ, denaturiert, isoelektrische Fokussierung) bzgl. der Proteineigenschaften ermitteln? nativ: Auftrennung erfolgt nach hydrodynamischem Volumen und IEP. denaturiert: Ladungen d. Proteins werden überdeckt, Volumen spielt untergeordnete Rolle. Auftrennung nach Molmasse IEF: pH-Gradient im Feld, Proteine lagern sich entsprechend ihres IEP bei versch. pH-Werten an.
- Welche Färbemethoden für die SDS-PAGE kennen Sie? Treffen Sie eine Aussage über die Sensitivität der beiden Methoden. Coomassie-Färbung: unspezifische Färbemethode mit einer Nachweisgrenze von 100 ng/Bande Silberfärbung: unspezifische Färbemethode mit einer Nachweisgrenze von 1-10 ng/Bande
- Beschreiben Sie ein einfaches Verfahren zur Proteinkonzentrierung durch Salzfällung und bewerten Sie dieses hinsichtlich seiner Vor- und Nachteile im Rahmen einer Proteinaufreinigung? Was müssen Sie bzgl. nachfolgender Aufreinigungsverfahren beachten? Bei der Ammoniumsulfatfällung wird zunächst der pH-Wert mit Ammoniak neutralisiert. Anschließend wird im Eisbad unter Rühren portionsweise Ammoniumsulfat zugegeben bis 80-85% Sättigung erreicht sind. Dabei wird der pH-Wert fortwährend kontrolliert. Anschließend wird 30 min lang zentrifugiert (10.000 g, 4°C) und dann der Überstand entfernt. Der Niederschlag wird eingefroren, nach Resuspension mit wenig Puffer dialysiert oder mit viel Puffer über Gelfiltration entsalzt. Alternativ: Anreicherung des gewünschten Proteins über fraktionierte Fällung.
- Benennen und beschreiben Sie kurz (Stichpunkte) die wesentlichen Prinzipien der vier wichtigsten chromatographischen Methoden zur Proteinaufreinigung. Ionenaustauschchromatographie: Bei jedem pH-Wert hat ein Protein aufgrund der Ladungen seiner Aminosäuren eine spezifische Nettoladung und bindet an eine Gelmatrix (z.b. DEAE-Cellulose) mit geeigneter Ladung. Die Elution kann durch einen Ionenstärkegradienten (z.b. konz. NaCl) oder einen pH-Gradienten erfolgen. Hydrophobe Interaktionschromatographie. Proteine mit hydrophoben Aminosäureresten binden an eine hydrophobe Säulenmatrix (Sepharose mit unpolaren Alcyl- oder Arylgruppen modifiziert). Elution erfolgt mit Puffern niedriger Ionenstärke. Affinitätschromatogrpahie: An die Säulenmatrix gekoppelte, geeignete Liganden binden hochspezifisch bestimmt Wechselwirkungspartner (z.b. Tags). Elution durch Zugabe freier Liganden oder ähnlicher Moleküle. Gelfiltration: Es kommt eine mit einer hydrophilen, polymeren Gelmatrix gefüllte Säule zum Einsatz. Bei der Gelmatrix handelt es sich um ein dreidimensionales Netzwerk aus polymeren org. Verbindungen (z.b. Polyacrylamid) mit hydrophilen Poren. Moleküle oberhalb einer bestimmten Größe können in den Poren nicht binden und wandern daher schnell durch die Säule. Auftrennung nach Größe.
- Was bedeutet der Begriff His-tag. Wie wird er in das Protein eingeführt (1-2 Sätze) und welches Prinzip liegt dieser Aufreinigungsmethode zu Grunde? Welche Vor- und Nachteile hat diese Methode? Es handelt sich um ein gentechnisch hergestelltes Fusionsprotein mit einem Polyhistidin-Tag bestehend aus 6 Histidinen. Der His-Tag bindet spezifisch an ein Säulenmaterial mit Ni2+-Ionen, wobei Chelat-Komplexe entstehen. Dies kann im Rahmen einer Affinitätschromatographie ausgenutzt werden. Die Elution erfolgt mit Imidazol oder einem Puffer mit niedrigem pH-Wert. Vorteile: Nachteile: Erfordert Einklonierung d. His-Tags