Biologie (Fach) / PB III Praktikum (Lektion)

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• Bärentraubenblätter lat. Drogenbezeichnung: Uvae ursi folium Stammpflanze: Arctostaphylos uva-ursi Fam.: Ericaceae Anwendung: entzündliche Erkrankungen der ableitenden Harnwege Inhaltsstoffe: 10-20% Gerbstoffe 6-15% Phenolglykoside (Arbutin) Flavonolglykoside ...
• Quantitative photometrische Gehaltsbestimmung von Arbutin und anderen Hydrochinonderivaten in Uvae ursi folium nach Ph. Eur. 1997 0,400 g pulv. Droge in 50 mL Wasser 30 min. lang unter Rückfluss zum Sieden erhitzen abkühlen lassen in einen 250,0 mL Messkolben überführen und mit Wasser auf 250,0 mL auffüllen Teilchen absetzen lassen 5,0 mL der überstehenden Lösung in einen Scheidetrichter pipettieren 45 mL Wasser und 1 mL einer 2%-igen (m/V) Lösung von Aminopyrazolon R hinzufügen, schütteln 0,5 mL Ammoniak-Lösung 3,5% R hinzufügen, schütteln 1 mL  8%-ige (m/V) Lösung von Kaliumhexacyanoferrat III R hinzufügen, schütteln genau (!) 5 min. stehen lassen wässrige Phase drei- bis viermal mit je 25 mL DCM R getränktem Wattebausch filtrieren, in einen 100,0 mL Messkolben vereinigen, auffüllen so entstandene Lösung bei 455 nm im Spektrophotometer dreimal vermessen, der Mittelwert geht in die Gehaltsrechnung ein Blanc-Lösung: DCM R
• Emerson-Reaktion als Grundlage des Nachweises für Arbutin Basenzusatz zur Abspaltung der Protonen der phenolischen Hydroxy-Gruppen Ox. m. Kaliumhexacyanoferrat führt zur Bildung des Chinons Zusatz von Aminopyrazolon führt letzlich zur Bildung eines Chinonimins unter Eliminierung von Wasser Aufweitung des π-Elektronen-Systems erlaubt UV-Spektroskopie bei 455 nm
• Fehlerquellen bei der Gehaltsbestimmung von Arbutin Wägefehler Reaktionszeit über- oder unterschritten ungenaue Verdünnung Rechenfehler, z.B. feherhafte Berücksichtigung der Verdünnungsschritte
• Erdrauchkraut allg. Fumaria officinales Fam.: Fumariaceae Droge: Fumariae herba Anwendung als Spasmolytikum bei Krämpfen im oberen Verdauungstrakt, bes. Gallenwege Volksmedizinisch als Laxans sowie schulmedizinische Nutzung der Fumarsäureester bei Psoriasis
• Erdrauchkraut Inhaltsstoffe Benzylisochinolinalkaloide wie Scoulerin, Protropin und Fumaricin
• Erdrauchkraut Quantifizierung nach Verfahren A Überführung der Alkaloide in die freien Basen mittels Ammoniak Freisetzung der Basen durch 4-stündige Mazeration anschließend wird mit Ether perkoliert zur Extraktion der Alkaloide Perkolat wird teilweise eingeengt und angesäuert, um Alkaloide in ionische und somit hydrophile Form zu bringen; Entfernung lipophiler Neutralstoffe erneutes Alkalisieren überführt Alkaloidsalze wieder in die Alkaloidbasen (lipiphile Form) erschöpfendes Ausschütteln mit Ether Zugabe eines Säureüberschusses (hier Schwefelsäure) und Abdestillation des Ethers Gehaltsbestimmung durch Rücktitration des Säureüberschusses mit NaOH gegen Methylrotmischindikator (purpur → grün)
• Benutzung Dragendorff beim Versuch Erdrauchkraut zur Überprüfung der vollständigen Extraktion der Alkaloide Alkaloide zeigen charakteristische gelb/orange Färbung (Fällungsreaktion Zusammensetzung Bismutoxidnitrat, Weinsäure und Kaliumiodid → Kalium-Tetraiodobismutat-Komplex basische aliphatische Amine werden protoniert (Weinsäure) → es entsteht ein Ionenpaar der Form [BiI4]- [HNR3]+
• Berechnung des Alkaloidegehalts in Erdrauchkraut Zugabe von 20,0 mL 0,01 M Schwefelsäure Rücktitration des nicht mit Protropin reagierenden Säurerestes mit 0,02 M NaOH Bsp. Verbrauch NaOH 16,6 mL Rücktitration: 20,0 mL-16,6 mL=3,4 mL → Menge Schwefelsäure, die mit Protropin reagiert hat N(Schwefelsäure)=c*V=0,01 M * 0,0034 L=3,4*10-5mol n(Schwefelsäure)=2n(Protropin)=6,8*10-5mol m(Protropin)=n*M=6,8*10-5mol*353,269 g/mol = 0,024 g 0,24 % Protropin
• Fehlerquellen Erdrauchkraut ungenügendes Volumen an Mazerationsflüssigkeit, Droge muss bedeckt sein! Anzahl der Ausschüttelungen mit Ether zu gering bzw. nicht ausreichend durchgeführt falscher pH nach Alkalisieren, nicht alle Moleküle werden deprotoniert und damit lipophil
• Ginkgo Inhaltsstoffe Flavonoide (mind. 0,5% nach Ph. Eur.) Flavonolmono- und diglykoside basierend auf Kämpferol und Quercetin Biflavone, z.B. Bilobetin und Ginkgetin Diterpenlactone Ginkgolide A, B, C, J (0,02-0,2%) Sesquiterpenlactone Bilobalid (0,02-0,06%) Anacardsäuren unerwünscht, da toxisch und allergen Ginkgolsäure (Höchstgrenze 5 ppm) ⇒Ginkgowirkung kommt durch Mischung zustande
• Ginkgo Wirkungen Wirkungen durchblutungsfördernd durch: PAF-Antagonismus durch Ginkgolid B Verbesserung der rheologischen Eigenschaften des Blutes neuroprotektiv (Bilobalid und Ginkgolide A und B) antioxidativ (Flavonoide) membranstabilisierend
• Ginkgo Indikationen primäre degenerative und vaskulär bedingte Demenz (TD: 120-240 mg) Unterstützung physikalisch-therapeutischer Maßnahmen Behandlung von Schwindelzuständen und Tinnitus (TD: 120-160 mg)
• Ginkgo Durchführung Gehaltsbestimmung Droge mit 60%iger Acetonlösung unter Rückflusskühlung erhitzen und extrahieren Lösung in 2 verschiedenen Kolben am Rotationsverdampfer eindampfen Rückstand des 1. Kolbens in MeOH (HPLC) lösen, mit Wasser (nanopure) auffüllen und zentrifugieren → Untersuchungslösung 1, nicht hydrolysierte Vergleichslösung Rückstand des 2. Kolbens in MeOH (HPLC) lösen, mit HCl R1 versetzen, zum Sieden erhitzen, mit Wasser (nanopure) auffüllen und zentrifugieren → Untersuchungslösung 2, hydrolysierte Vergleichslösung 10,0 mL Quercetin-Dihydrat R in 20 mL MeOH lösen, mit 15 mL verdünnter HCl R und 5 mL Wasser R versetzen, mit MeOH R auf 50,0 mL verdünnen → Referenzlösung
• Gehaltsbestimmung Ginkgo Flavonoidglykoside [%]=2*(F1*m1*2,514*p)/(F2*m2) F1=Summe aller berücksichtigten Peakflächen der Untersuchungslösung (bei 370 nm) F2=Peakfläche, die dem Quercetin der Referenzlösung entspricht (bei 370 nm) m1=Einwaage des Quercetins zur Herstellung der Referenzlösung in g m2=Einwaage der Droge zur Herstellung der Untersuchungslösung in g p=Prozentgehalt an wasserfreiem Quercetin (302,2 g/mol) in Quercetin-Dihydrat R (338,3 g/mol) 2=Korrekturfaktor 2,514= Umrechnungsfaktor vom Quercetin-Dihydrat auf M 757 (Mittelwert der Flavonoide)
• Massenspektrometrie Ginkgo M(Flavonoid) 609,4g/mol+1H+=610,4 g/mol Rutin M=610,5 g/mol M (1. Zucker) 609,4 g/mol - 463,3 + 17 g/mol +1H+=164,1g/mol Rhamnose M=164,2 g/mol M (2. Zucker) = 463,3 g/mol + 17 g/mol + 1H+ - 300,4 g/mol=180,9 g/mol Glucose/Galactose M=180,1 g/mol
• Ginkgo - mögliche Fehlerquellen unzureichende Extraktion (zu heiß, zu kalt, nicht lange genug) falsches Volumen in Kolben übertragen unvollständige Hydrolyse der Glykoside nach HCl-Zugabe falsche HCl-Konzentration Apparaturfehler
• Belladonnablätter Droge deutsch: Belladonnablätter Droge latein: Belladonnae folium Stammpflanze: Atropa belladonna (Tollkirsche) Fam.: Solanaceae (Nachtschattengewächse)
• Stramoniumblätter Droge: Stramonii folium (Stramoniumblätter) Stammpflanze: Dature stramonium (weißer Stechapfel) Fam.: Solanaceae (Nachtschattengewächse)
• Inhaltsstoffe Stramonium- und Belladonnablätter Tropanalkaloide: S-(-)-Hyoscyamin Scopolamin Apoatropin Tropin pharm. relevant: Atropin (R/S)-Hyoscyamin (Racemat) und Scopolamin (in Pflastern gegen Reiseübelk.)
• Pharmakologie des Atropins Parasympatholytikum kompetitiver Antagonismus an muskarinergen ACh-Rezeptoren es kommt zu anticholinergen Effekten
• Bestimmung des Gesamtalkaloidgehaltes von Belladonnablätter Alkaloidanreicherungsverfahren nach Verfahren A: Extraktion mittels ammonialkalischer Lösung Alkaloide liegen deprotoniert vor und sind löslich in lipophilem LM mehrmaliges Ausschütteln mit Ether/DCM-Gemisch neben den Alkaloidbasen auch lipophile Neutralstoffe Einengen der Lösung und Zusatz von Ether Entfernen von DCM, sodass bei Säurezusatz nur 2 Phasen vorliegen Mehrfaches Ausschütteln mit Schwefelsäure Alkaloide liegen protoniert vor und gehen in wässrige Phase über lipophile Neutralstoffe verbleiben im Ether wässrige Phase mit Ammoniak alkalisieren Alkaloide liegen wieder als freie Basen vor mehrfaches Ausschütteln mit DCM Alkaloide in org. Phase zur Trockene eindampfen und nach Zusatz eines def. Vol. Schwefelsäure DCM entfernen anschließend indirekte Titration der Alkaloidbasen
• Stramonium- und Belladonnablätter quantitative Bestimmung der Alkaloide durch indirekte Titration Zusatz eines definierten Vol. 0,02 N Schwefelsäure Titration des Überschusses Schwefelsäure mit 0,02 N NaOH-Maßlösung Ind. Methylrot-Mischindikator H2SO4 + 2 NaOH → Na2SO4 + 2 H2O
• Methylrot-Mischindikator Indikator aus 2 Farbstoffen Kontrastindikator Bildung einer grauen Mischfarbe im Bereich des Äquivalenzpunktes besser zu erkennen als bei Umschlag von rot nach gelb (Methylrot) Umschlagspunkt bei pH 4,4 bis 6,2 → grauer Farbton
• Stramonium- und Belladonnablätter mögliche Fehler DCM nicht ausreichend entfernt nicht ausreichend angesäuert bzw. alkalisiert und damit unvollständiges Ausschütteln der Alkaloidbasen unvollständiges Entfernen des Ammoniaks (Verwendung zum Alkalisieren) VOR Zugabe der Schwefelsäure (wird für die Rücktitration gebraucht)
• Schöllkraut allgemein Chelidonii herba Stammpflanze: Chelidonium majus Familie: Papaveraceae perennierende (ausdauernde), bis 50 cm hohe Ruderalpflanze gelb gefärbter Milchsaft Frucht ohne Schote heimisch im europäischen/asiatischen Raum Droge: zur Blütezeit gesammelte Sprosse
• Schöllkraut Inhaltsstoffe Alkaloidgehalt 0,1-1% über 20 Alkaloide bekannt wichtig: Coptisin, Chelidonin, Chelerythrin und Sanguinarin Alkaloide: nicht basisch, daher nicht wie üblich über Säure-Base-Titration bestimmbar
• Schöllkraut Indikationsgebiet innere Anwendung bei krampfartigen Beschwerden der Gallenwege und des GIT → obsolet (Leberschädigung) Bestandteil von Iberogast Volksmedizin: Einsatz bei z.B. Warzen (cytostatisch aktive Alkaloide des Milchsaftes)
• Schöllkraut Versuchsdurchführung Ziel: Bestimmung des Gesamtgehaltes an Alkaloiden, die Acetalgruppen tragen Extraktion der Alkaloide mit Essigsäure Alkalisierung mit NaOH Ausschütteln der Alkaloide als Basen mit DCM Entfernen des LM: zunächst wird im Vakuum zur Trockene eingedampft erneute Zugabe von Isopropanol bis kein Essiggeruch mehr wahrnehmbar ist, eindampfen lösen in EtOH Zugabe von Schwefelsäure zur Abspaltung von Formaldehyd aus Methylendioxidgruppen Durchführung der Chromotropsäurereaktion in je einen 25 mL Messkolben werden pipettiert: Blindlösung: 5,0 mL 2N-Schwefelsäure Probelösung: 5,0 mL Stammlösung beide Messkolben werden unter Umschwenken mit 5,0 mL Chromotropsäure-Reagenz versetzt und mit 96%iger Schwefelsäure zu 25,0 mL verdünnt photometrische Messung
• Chinin aus Chinchonae cortex Stammpflanze: Cinchona pubescens Familie: Rubiaceae Indikation: Droge: als Bittermittel Chinin bei Wadenkrämpfen und Malaria
• Chinarinde Praktikumsversuch mit Calciumhydroxid mischen und trocknen: Alkaloid als freie Base freisetzen Extraktion mit DCM in der Soxhlet-Apparatur für 6 Stunden ausschütteln in 15%iger Schwefelsäure: Alkaloidsalz geht in's Wässrige über pH auf 4,5 einstellen mit anschließender Kaliumnatriumtartrat-Fällung von Chinin und Cinchonidin: Trennung der Diastereomere Alkalisierung auf pH 1: Tartrate als freie Basen Extraktion mit DCM und anschließend mit Schwefelsäure Einstellung des pH auf 6: Chinin kristallisiert als Sulfat aus Identitäts- und Reinheitsbestimmung mittels DC und HPLC DC wird in Toluol/Ethylacetat/Diethylamin (56/16/8) entwickelt, anschließend mit Schwefelsäure besprüht und Auswertung bei 365 nm → Fluoreszenzintensivierung Alternative: Besprühen mit Dragendorff-Reagenz (Nachweis tert. Amine)
• Flavonoide verwendete Drogen Betulae folium: Förderung der Harnbildung Gehalt Ph.Eur. 1,5% Hyperosid Crataegi folium cum flore: Cardio/Vaso-protektiv 1,5% Hyperosid Passiflorae herba: Sedativum, Anxiolytikum 1,5% Vitexin Rutae herba: keine off. Ind., keine Gehaltsangabe Sambuci flos: diaphoretisch, Expectorans 0,8% Isoquercitin
• Flavonoide allgemeine Wirkungen protektiv gegen Venenerkrankungen → Weißdornblätter mit Blüten protektiv gegen Erkrankungen des Leberparenchyms → Mariendistelfrüchte sedativ und anxiolytisch → Passionsblumenkraut spasmolytische Wirkung erhöhte Toleranz von Sauerstoffmangel diuretische Wirkung → Birkenblätter schwach Östrogen antimikrobielle Wirkung zusätzlich: antioxidativ antiallergisch antiphlogistisch antiviral antiproliferativ/anticancerogen
• Flavonoide quantitative Bestimmung im Praktikum Prinzip: Flavonoid-Glykoside + HCl → Aglyka und Zuckerkomponente Extraktion mit Ethylacetat → isolierte Aglyka + AlCl3 → Chelatkomplexe photometrische Bestimmung der Absorption willkürlicher Bezug auf ein definiertes Flavonoid (z.B. Hyperosid)
• Flavonoide Versuch praktische Durchführung Pulverisierung der Droge Zusatz von 1 mL Methenamin-Lösung (Urotropin) Verhinderun einer Anthocyanidinbildung von Catechinderivaten aufgrund des Säurezusatzes wird Methenamin als Reduktionsmittel zugesetzt mehrfache Extraktion mit Aceton/HCl (Rückfluss) Filtration Verdünnung mit Aceton und Wasser Ausschütteln und Waschen mit Ethylacetat Trocknung mit Natriumsulfat Versetzen mit Aluminiumchlorid Verdünnung mit methanolischer Essigsäure photometrische Messung nach 30 min. bei 425 nm
• Flavonoidversuch mögliche Fehlerquellen falsches LM vor dem Filtern abkühlen lassen nicht richtig ausgeschüttelt Aluminiumchlorid-Reagenz R fehlerhaft hergestellt
• Arnikablüten Arnicae flos aus Arnica montana, Asteraceae, echte Arnika (auch Bergwohlverleih) Arnica chamissonis ssp. foliosa
• Arnikablüten Inhaltsstoffe Sesquiterpenlactone ätherische Öle Flavonoide Cumarinderivate Phenolcarbonsäuren (Zimtsäure und Derivate) Polyine
• Arnikablüten als Antiphlogistikum nur topisch, außer in homöopathischer Dosis bei Prellungen, Verstauchungen und rheumatischen Beschwerden Wirkung durch Hemmung von NF-κB und NF-AT, dadurch wird Aktivierung der Entzündungskaskade gehemmt hohes Risiko von Kontaktallergien
• Arnikablüten Quantifizierung HPLC (Ph.Eur.) GC (Praktikumsversuch Extraktion mit MeOH 50% (V/V) Zugabe des internen Standards (Santonin) Abtrennung von Begleitsubstanzen und Vorbereitung zur GC durch Ausschütteln in Ethylacetat und Zugabe von Aluminiumoxid Gefriertrocknung vor GC
• Arnikablüten Quantifizierung GC Rechnung Die Flächen der relevanten Peaks werden addiert und der Gehalt unter Verwendung des internen Standards (skf) für Helenalin-tiglat (?) bestimmt skf=(m(Probe)*A(interner Standard))/(m(interner Standard)*A(Probe))
• Penicillium chrysogenum Schimmelpilz aus der Gattung der Pinselschimmel wichtiger Produzent von Beta-Lactam-AB heute industriell in Bioreaktoren gewonnen
• Isolierung von Benzylpenicillin aus einer Fermentation des Pilzes Versuchsdurchführung saurer Ethylacetat-Extrakt aus einer Fermentation von Penicillium chrysogenum gelöst in 90%igem MeOH Benzylpenicillin liegt protoniert und damit unpolar vor dreimaliges Ausschütteln mit n-Hexan lipophiles Benzylpenicillin in n-Hexan, hydrophilere Bestandteile in MeOH eindampfen zur Trockene (CAVE: hitzelabil!) Aufnahme in DCM/MeOH (1:1) Auftragen auf Sephadex-Säule: Größenausschlusschromatographie Säuleneluat tropft in Reagenzgläser des Autokollektors Wechselintervall 20 min. Tropfgeschwindigkeit: 1 Tropfen/6 sec aufgefangene Fraktionen einzeln auf DC-Platte tüpfeln und in Ethylacetat/MeOH/Wasser (30:5:4) entwickeln Auswertung bei 254 nm und 366 nm im UV-Licht, Besprühen mit Anisaldehyd und Entwicklung auf Heizplatte HPLC-Analyse zur Identifizierung des Benzylpenicillin-Fraktion Gewinnung der Reinsubstanz mittels präparativer HPLC
• Größenausschlusschromatographie Sephadex-Säule: separation Pharmacia dextran α-1,6-α-1,4-verknüpfte zyklische Zucker (polar) Auftrennungsprinzip: nach Größe Bildung von Poren kleine Analyten werden besser zurückgehalten als große zusätzliche Auftrennung nach Polarität: polare Analyten wechselwirken länger mit der Säule als unpolare
• Javanische Gelbwurz Droge: Curcumae xanthorrhizae rhizoma in Scheiben geschnittener und getrockneter Wurzelstock Stammpflanze: Curcuma xanthorrhiza /javanische Gelbwurz) Familie: Zingiberaceae
• javanische Gelbwurz Inhaltsstoffe ätherisches Öl Curcuminoide (1-2% Dicinnamoylmethanderivate), Polyketid
• javanische Gelbwurz Anwendung Choleretikum Gewürz- und Lebensmittelfarbstoff
• Quantitative Bestimmung der Dicinnamoylmethanderivate (Curcuminoide) in Curcumae xanthorrhizae rhizoma erhitzen der pulverisierten Droge mit Essigsäure 98% R für 30 min bei 90°C Zugabe von Borsäure und Oxalsäure erwärmen des Ansatzes bei 90°C nach Abkühlen mit Essigsäure 98% R zu 100,0 mL auffüllen 5,0 mL der Lösung mit Essigsäure 98% Rauf 50,0 mL auffüllen Absorptionsmessung bei 530 nm gegen Essigsäure 98% R
• Mariendistelfrüchte Inhaltsstoffe Gemisch aus Flavonolderivaten (3%) Silybin Silydianin Silchristin
• Mariendistelfrüchte Indikation bei Lebererkrankungen Antidot bei Knollenblätterpilzvergiftung

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