Mikrobiologie (Fach) / Handout 3 (Lektion)

Wachstum von MO

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• Nährstoffe der MO - Makroelemente: in großen Mengen gebraucht -> C,O, H, N, S, Ka, Ca, P, Mg, Fe - Mikroelemente (Spurenelemente): Bestandteile von Enzymen, Cofaktoren (Vitaminen) -> Zn, Mn, Mo, Co, Ni, V, B, Cl, Na, Se,... - Hauptbestandteile der Nährmedien: C-Quelle, N-Quelle, Wuchsstoffe, anorganische Salze, Wasser  
• Nährmedien - Minimalmedium: erfüllt Mindestansprüche zum Wachstum des MO; z.B.: D-Glucose (Energielieferant), Ammonium-Ionen, Sulfat-Ionen - Vollmedium: darüber hinaus wachstumsfördernde Stoffe, Suppline; z.B.: Pepton, mehrere AS als Stickstoffquelle/ Schwefelquelle - Komplexmedium: enthält komplexe, organische Bestandteile, die chem. nicht genau definiert sind; z.B.:Hefeextrakt, Fleischextrakt - Synthetisches Medium: enthält ausschließlich chemische genau definierte Stoffe zu definierten Konzentrationen   
• Einfluss des pH-Wertes auf Wachstum - grundsätzlich sind Biomembranen relativ undurchlässig für Protonen -> Beeinträchtigungen der Zelle erst bei hohen delta pH - Empfindlichkeit gegenüber pH-Extremen: pH Wert hat Einfluss auf Ladungen funkioneller Grupen -> intramolekulare Bindungen -> Form, Aktivität - Anpassung bestimmter MO durch Homöostase-Systeme: halten pH-Wert im Inneren der Zelle aufrecht (pH 6-8) - neutrophile: pH 6-8 -> Bacillus subtilis - acidophil: saure Umgebung -> Milchsäurebakterien - alkaliphil: basische Umgebung -> Natronococcus (salzige Natronseen) 
• Temperaturbereiche des Wachstums von MO - Mesophil: 20-40 °C -> Escherichia coli, Bacillus, subtilis - psychrophil: niedrige Temberaturen unterhalb des Temperaturbereichs der Mesophilen -> Vibrio marinus (Tiefsee) - thermophil: hohe Temperaturen oberhalb des Temperaturbereichs der Mesophilen -> Methanophyrus (Vulkangebiete) 
• Einfluss von Sauerstoff auf Wachstum der MO - aerob: benötigt Sauerstoff für Wachstum (Mensch) - anaerob: stirbt an Sauerstoff (Methanococcus jannaschii) - fakultativ anaerob: können unter oxischen und anoxischen Bedingungen wachsen - mikroaerophil: Wachstum nur bei geringen Sauerstoffmengen - aerotolerant anaerob: können in Gegenwart von Sauerstoff überleben, nutzen diesen aber nicht
• prokaryotische Zellteilung - Replikation der Terminationsstelle der DNA löst Wachstum des Septum aus - Vermehrung des Inhaltes des Cytoplasmas, Erweiterung der Zellwand, Zellhülle - Septierung von außen nach innen -> abschnüren zu 2 Tochterzellen - Zellteilung
• FtsZ - Hauptseptierungsprotein der prokaryotischen Zellteilung - mutierte Gene aus E. coli - homolog zum eukaryotischen Tubulin (Spindelapparat -> euk. Mitose und prok. Zellteilung haben gemeinsamen Vorläufer) - bilden kontraktilen Ringum Äquator der Zelle in Form von polymeren Filamenten - rekrutieren übrige Proteine des Zellteilungsapparates -> Initiation
• Generationszeit - Zeitdauer, in der sich Zahl der Individuen (prokaryotische Zellen) verdoppelt - abhängig von Baktierienspezies, Medium, Temperatur, pH - z.B.: E. coli: 20 min - g = t/n (von N0 auf N Individuen im Zeitraum t bei n Teilungen)
• 1. Zahl der Zellen nach n Teilungen 2. Anzahl der Teilungen 3. Teilungsrate 1. N = N0 * 2^n 2. n = (logN-logN0)/log2 3. v = n/t
• Phasen des Wachstums von MO 1. lag-Phase: Anlaufphase, Vorbereitung der Zallmaschinerie auf Wachstum, Anpassung an Umgebung 2. log-Phase: exponentielles Wachstum, den Wachstumsbedingungen entsprechende maximale Wachstumsrate 3. stationäre Phase: Zellzahl bleibt konstant, Nährstoffmangen, Ansammlung an Abfallprodukten, möglw. Sporenbildung, Reduktion der Größe 4. Absterbephase: negativ exponentiell, ausgedehnt 
• Diauxie - zweiphasiges Wachstum -> Verwertung 2 verschiendener Energiequellen - 1. exponentielle Phase: 1. Energiequelle (E. coli: Glucose), die leichter zu verwerten ist (benötigt weniger Enzyme) wird zunächst vollständig verbraucht  - lag-Phase: 1. Energiequelle verbraucht -> Induktion der Enzyme zur Verwertung der 2. Energiequelle - 2. exponentielle Phase: 2. Energiequelle (E. coli: Lactose) wird verwertet (längere Verdopplungszeit)
• Betriebsparameter eines Bioreaktors - Zusammensetzung des Nährmediums - Aufrechterhaltung v. Temperatur, pH - ggf. Sauerstoffversorgung - Schaumbildung - Homogenisierung - Batch / kontnuierlicher Betrien
• Batch-Prrozess - diskontinuierlicher Chargenprozess - volsständig befüllen des Reaktionsgefäßes - Reation der Edukte (Konzetration sinkt) zu Produkten (Konz. steigt) - Entleerung -> Downstream-Processing - einfache Apperatur
• Fed-Batch-Prozess - teilweise befüllen des Reaktionsgefäßes mit Edukten - Edukt reagiert zu Produkt - "Zufütterung" mit Edukten - Entleerung -> Downstream-Processing - gezielte Steuerung des Wachstums weniger Substratinhibierung, höhere Endkonzentration an Biomasse
• kontinuierlicher Betrieb - im Chemostat: kontinuierliche Zugabe frischen Midums, entsprechende Menge an Produkt, Zellen abgeführt => Fließgleichgewicht - Substratkonzentration: limitierender Faktor des Wachstums - erhöhte Verdünnungsrate -> erhöhte Wachstumsrate -> zunehmender Bakterienausstoß - Bakteriendichte über weite Bereiche konstant - wash-out: Verdünnungsrate am Auswaschpunkt Dc
• Zählkammer - Bestimmung der Gesamtzellzahln (lebend und tot) - Onjektträger mit Stegen, Vertiefungen, Präzisionsraster (b-Feld mit 16 c-Feldern)  - Deckglas begrenzt definiertes Volumen - Bakteriensuspension in Vertiefung -> zählen der Bakterienzelln unter Mikroskop - Berechnung der Gesamzahl
• Koch'sches Plattengussverfahren - Bestimmung der Lebendzellzahl - Verdünnungsreihe homogener Zellsuspensionen - vermengen (ausspateln) mit flüssigem Nähragar (40-45 °C) in Petrischalen - Kolonien zählen nach Bebrüten  
• Bestimmung der Zellmasse - optisch: Trübung der Suspension ermitteln -> Zelldichte - Grundlage: suspendierte Partikel streuen Licht - Turbidimetrie: Extinktionsmessung  - Nepehlometrie: Messung des seitlich gestreuten Lichtes
• Quorum Sensing - Art der Kommunikation zur Kontrolle des Verhaltens einer Population vom MO -> Zelldichte-abhängige Regulation der Genexpression - Bsp. Vibrio fischeri aus Leuchtorgan eines Zwergtintenfisches  - Zellen sezernieren Autoinduktor N-Acetyl-Homoserinlacton - kritische Konzentration wird bei hoher Zelldichte erreicht  - Schwellenkonzentration im extrazellulären Raum -> Autoinduktor diffunidert zurück in Zelle - bindet an regulatorisches Molekül LuxR -> Komplex aktiviert Transkription der lux-Gene -> Enzym Luciferase wird gebildet -> Biolumineszenz
• Notwendigkeit der Hemmung/Abtötung von MO - Hygiene - Hemmung/Abtötung pathogener Keime - Haltbarmachung von Lebens- und Futtermitteln - undustrielle Fermentationsprozesse
• dezimale Reduktionszeit - Zeit, nach der bei gegebener Temperatur nur noch 10% der ursprunglichen Population überleben - 70 °C -> D=3min; 60 °C -> D=12min 
• Sterilisation im Autoklaven - thermische Sterilisation im Überdruckbereich mit Sattdampf - Anwendung bei Lösungen, Nährmedien, Gummi, einige kunststoffe, infektiöses Material - höhere Temperaturen durch höheren Druck -> Abtötung hitzeresistenter Dauerformen (Sporen) - Methode: 121 °C bei 2 bar für 15-30 min oder 134 °C bei 3 bar für 5-20 min
• Sterilfiltration - Methode für hitzeempfindliche Lösungen (Vitamine, Antibiotika) - kleine Poren des Filters halten Bakterien zurück 
• Desinfektionsverfahren - physikalisch-thermisch: Heißwasser, strömender Dampf, Niederdruckdampf (Wäsche, Lebensmittel, Spülmaschinen) - pysikalisch-nicht thermisch: UV-Strahlen (Raumluft, Oberflächen) - chemisch: Alkohole, Tenside,.. (Haut, Flächen, Wasser) - chemisch-thermisch: feuchte Hitze und chem. Desinfektionsmittel 
• Konservierungsverfahren - physikalisch: Hitze (Pasteurisierung), tiefe Temperaturen, Entkeimungsfiltration, Trocknung, Strahlenbehandlung - chemisch: Säuerung, räuchern (wasserentziehend), salzen (wasserentziehend), suckern (ca. 50 % Saccharose ist wachstumshemmend), Alkohol und Säure (Ethanol, Schwefelung), Hopfenextraktstoffe (Bier)
• xerophil - Lebewesen, die trockene Lebensräume bevorzugen - z.B.: Salinenkrebs, Pilzarten, Fadenwürmer, Mikroben
• halophil - Organismen bevorzugen Umgebung mit erhöhtem Salzgehalt - z.B.: Halobacterium, Dunaliella salina (Mikroalge)
• bakteriostatisch - Hemmung des Wachstums von Bakterien, Dauerformen werden nicht abgetötet - totale Zellzahl und Anzahl der lebensfähigen Zellen bleibt konstant 
• bakterizid - starke Schädigung der Bakterienzellen, die zum Zelltod führt - totale Zellzahl konstant, Anzahl lebensfähiger Zellen geht mit der Zeit gegen Null
• bakteriolytisch - Tod der Bakteriezelle durch Auflösung der Zellwand - totale Zellzahl und Anzahl der lebensfäigen Zellen gehen gegen null
• 4 weltweit am häufigsten Antibiotika und deren Wirkung - Cephalosporin ( 37 %): Bakterizid, gehören zu beta-Lactam-Antibiotika, Hemmung der Zellwandsynthese - Makrolid-Antibiotikum (11 %): bakteriostatisch, Hemmung der Proteinbiosynthese durch Anlagerung an 50 S Unterheit des Ribosoms  - Chinolon (14 %): synthetisch hergestellt, Inaktivierung des Enzyms Gyrase (entdrillt DNA) - Penicilline (17 %): bakteriostatisch, behindern Zellwandsynthese
• beta-Lactam-Antibiotika - Gruppe der Antibiotika gegen Legionellen, Chlamydien, Mykoplasmen - bakterizid, Hemmung der Peptidoglycansynthese bei Zellteilung (unwirksam gegenüber Eukaryoten -> keine Zellwand)  - Penicilline, Cephalosporine -> gemeinsames chemisches Merkmal ist der beta- Lactam Ring, unterschiedliche Seitenketten bestimmen antibakterielle Wirkung   
• Tetracycline - Gruppe von Antibiotika, synthetisiert von Streptomyceten - bakteriostatisch, Translation: Bindung an 30S-Unterheinheit des Ribosoms -> Hemmung der Proteinbiosynthese durch Blockade des t-RNA-Eingangs - Grundgerüst aus 4 Kohlenstoff-Sechsringen - unterschiedliche Reste -> Chlortetracycline, Oxytetracycline 
• Inaktivierung von Antibiotika durch Enzyme - inaktivierende Enzyme häufig auf Resistenzplasmiden codiert - Bsp.: beta-Lactamase spaltet Lactamring des Penicillins  - Bsp: Chloramphenicol Acetyltransferase acetyliert OH-Gruppen des Antibiotikums -> Bindung an Ribosom nicht mehr möglich - Bsp: Aminoglykosid-Phosphotransferase phosphorylieren z.B. OH-Gruppe des Streptomycin 
• Test auf Empfindlichkeit gegenüber Antibiotika - Hemmhoftest: - Argarplatten werden erregerhaltigem Material beimpft -> Trübung zeigt Bakterienbewuchs - in Antibiotika getränkte Scheibchen werden auf Argaroberfläche gelegt -> Antibiotikum diffundiert in Argarschicht - Bildung von Hemmhöfen -> Bakterien sind gegen dieses Antibiotikum NICHT resistent 
• typische Bedingungen für Dampfsterilisation im Autoklav - 121 °C, 2 bar, 15-30 min - 134 °C, 3 bar, 5-20 min
• typische Bedingungen für Hitzesterilisation mit trockener Hitze - 160-200 °C, 30-180 min (Glasgeräte, Metall, Keramik, Teflon) - 2-4 mal bei 70-100 °C, dazwischen bebrüten (Lösungen, Nährmedien) -> fraktionierte Sterilisation
• autotroph Organismen, die sich aus anorganischen C-Quellen selbst organische Verbindungen aufbauen
• chemolithotroph Organismen, die anorganische Verbindungen oder Ionen zur Energiegewinnung nutzen. z.B.: NH4+, NO2-
• hyperthermophil Organismen, deren Wachstumsoptima bei 80-113 °C liegt. z.B.: Vulkangebiete
• chemotroph Organismen gewinnen Energieaus chemischen Stoffumsetzungen (Oxidations-Reduktions-Reaktionen)

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