Proteine (Fach) / Proteine TUM (Lektion)

Proteine, Skerra, TUM

Diese Lektion wurde von FelixSimsam erstellt.

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• Welche zwei Hilfsgleichungen werden verwendet, um die experimentellen Daten letztlich befriedigend simulieren zu können?
• Wodurch macht sich die Kooperativität der Proteinfaltung in der Kurve bemerkbar und in welcher der Gleichungen tritt diese als Parameter auf? Sigmoidaler Kurvenverlauf deutet auf Kooperativität hin Kooperativitätsparameter m Gleichung der Observablen
• Formulieren und benennen Sie die beiden gebräuchlichsten Denaturierungsmittel.
• Geben Sie an, welches davon stärkere Wirkung hat sowie zu welchem/n Produkt/en sich eines davon chemisch zersetzen kann. Guanidiniumchlorid hat die stärkere Wirkung (6M reichen aus, bei Harnstoff werden 8M benötigt) Harnstoff kann sich zu Cyanat und Ammonium zersetzen
• Betrachten Sie die klassischen Versuche zur Stabilisierung des T4-Lysozyms durch Protein-Engineering: Welche positiven und negativen Effekte sind zu erwarten, wenn man Cysteinreste einführt? ·         Positiv: Erhöhung der thermischen Stabilität durch kovalente Quervernetzung innerhalb der Polypeptidkette bei der oxidierten Form der Mutante Kontrolle der Enzymaktivität über das Redoxpotential, wenn eine Disulfidbrücke eingeführt wird, die das aktive Zentrum überbrückt und somit den Zugang für das Substrat sterisch hindert ·         Negativ: die reduzierte Form der Mutante ist weniger stabil als der WT, da die Einführung der Cys-Reste andere wichtige Wechselwirkungen unterbricht sterische Hinderung des aktiven Zentrums Fixierung flexibler Regionen in der Tertiärstruktur (Schleifenumfang)
• Erläutern Sie anhand eines Energieschemas, weshalb es dabei letztlich zu einer Stabilisierung kommen kann. Disulfidbrücken destabilisieren den entfalteten Zustand und stabilisieren dadurch
• Welche beiden gegenläufigen Effekte sind zu berücksichtigen, wenn man hydrophobe Seitenketten mit unterschiedlicher Größe gegeneinander austauscht? ·         Es gibt Kavitäten, die mit größeren Resten gefüllt werden können, die Packungsdichte eines Proteins kann also erhöht werden → stabilisierend (Die Füllung der Kavität kann aber auch leicht eine „Überpackung“ darstellen und nicht stabilisierend wirken) ·         Durch den Austausch hydrophober Seitenketten können neue Kavitäten geschaffen werden oder bestehende vergrößert werden → destabilisierend  
• Weshalb ist gerade der Austausch durch Alanin so gut geeignet, um funktionell wichtige Aminosäuren in einem Protein zu identifizieren? Vereinfachte Analyse des Wegfalls eines großen Teils der Seitenkette: Alanin besitzt nur funktionell weitgehend neutrale Methylgruppe; wird eine funktionelle Aminosäure gegen Ala ausgetauscht hat dies i.d.R. einen Verlust der Proteinfunktion zur Folge
• Welche Vor- und Nachteile bietet Methionin beim "Packen" einer hydrophoben Kernregion? ·         Vorteile: hohe Flexibilität der linearen Seitenkette (→ Anpassungsmöglichkeit an sterische Randbedingungen) ·         Nachteile: geringere Transferenergie, Seitenkettenflexibilität liefert einen entropisch ungünstigen Beitrag zur Proteinfaltung und könnte zur Bildung einer „Molten Globule“-Struktur führen, instabiler als AS mit verzweigter Seitenkette
• Betrachten Sie einen der klassischen Versuche zum Engineering des Subtilisins durch Veränderungen am aktiven Zentrum der Proteinstruktur unter Substitution gegen Alaninreste: Welche drei Aminosäuren spielen bei der Hydrolyse des Peptidsubstrats ei Aspartat, Serin und Histidin → katalytische Triade
• Zu welcher Enzymklasse gehört Subtilisin, welches mechanistisch damit verwandte Enzym kennen Sie, und in welcher Beziehung stehen die beiden miteinander? Enzymklasse: Hydrolasen, Familie der Serinproteasen Mechanistisch verwandtes Enzym: Thrombin, Plasmin (Serinproteasen), spalten Blutgerinnsel auf Beziehung?
• Welcher spezielle Schritt ist bei diesen Proteinen nötig, um letztlich zum funktionellen Genprodukt zu kommen; welchen Trick hat man bei den Mutanten des Subtilisins angewandt und was mußte man bei der Reinigung beachten? Produktion der rekombinanten Varianten in transformierten B. subtilis-Zellen in Ggw. eines B. subtilis Wildtyp-Stamms zwecks Maturierung des Präproenzyms. Reinigung aus dem Kulturüberstand und Abtrennung vom Wildtyp-Enzym mittels Thiol-Sepharose anhand der zusätzlich eingeführten Mutation S24C (oberflächenexponierter Cys-Rest/ „kovalente Chromatographie“)
• Formulieren Sie den Reaktionsmechanismus zur Hydrolyse der Peptidbindung, und benennen Sie die vier wichtigen Stadien dabei
• Was war die wesentliche Aussage aus dieser Protein-Engineering Studie? ·         Die Reste der Triade agieren stark synergistisch und beschleunigen nur zusammen die Substrat-Hydrolyse ·         Im Gegensatz zu Resten, die an der Substratbindung beteiligt sind, wird vor allem die Wechselzahl dramatische erniedrigt, wohingegen die Michaelis-Konstante nur wenig beeinflusst wird ·         Weitere Reaktionsbeschleunigung um den Faktor ~1000 durch Reste, die den Übergangszustand stabilisieren
• Beschreiben Sie in diesem Zusammenhang das Phänomen der "Substrate-assisted Catalysis" in einem Satz! His-Seitenkette an P2 des Substrats kann die Imidazol-Gruppe der katalytischen Triade sterisch beinahe perfekt ersetzen → Substrat N-Succinyl-Phe-Ala-His-Phe-pNitronailid wird (bei pH 8) um den Faktor 400 schneller hydrolysiert als das Substrat mit P2-Ala oder P2-Gln
• Nennen Sie die beiden Reagenzien und formulieren Sie die proteinchemischen Reaktionen, mit denen man (a) Trypsin und (b) RNase inaktivieren kann. ) DEPC Phenylmethansulfonylfluorid PMSF  
• Formulieren Sie die Bildung einer Isopeptidbindung anhand einer Asn-Gly-Sequenz.
• Leiten Sie in einem Gedankenexperiment anhand der relevanten Parameter her, wieviele unterschiedliche Polypeptide im Verlauf der irdischen Evolution maximal entstehen konnten. ·         Planet Erde: 4 ∙ 109 Jahre ·         Planet bedeckt mit Ozean (4km tief): 1,2 ∙ 1018 m3 ·         Darin dichte Kultur von E.coli, infiziert mit Bakteriophage M13 ·         Maximale Replikationsrate: 3 Generationen pro Stunde ·         Hohe Mutationsfrequenz: jeder Phage kodiert für ein neues Protein → 1055 unterschiedliche Proteine (oberer Wert unter optimalen Bedingungen)
• Setzen Sie diesen Schätzwert in Beziehung zu den Sequenzkombinationen, die für ein kleines globuläres Protein von 60 Aminosäuren möglich sind. Polypeptid mit 60 Aminosäuren: 2060 = 1,15 ∙ 1078  Sequenzkombinationen → 1,15 ∙ 1078  -  1055 = 1,15 ∙ 1078  Proteine wurden niemals in der Natur synthetisiert!
• . Nennen Sie (a) alle potentiell positiv geladenen, (b) alle potentiell negativ geladenen sowie (c) alle aromatischen Aminosäuren (vollständiger Name und Dreibuchstabenkode). a)      Lysin (Lys), Arginin (Arg), Histidin (His) b)      Aspartat (Asp), Glutamat (Glu), Cystein (Cys), Tyrosin (Tyr), Histidin (His) c)       Histidin (His), Phenylalanin (Phe), Tyrosin (Tyr), Tryptophan (Trp)
• Geben Sie für je einen Vertreter der drei Klassen die Strukturformel an. a)                                                                b)                                       c)
• Wozu wird Harnstoff bei der biophysikalischen Charakterisierung von Proteinen verwendet und was sind die beiden relevanten Wirkmechanismen dabei? De- und Renaturierungsstudien, Rückfaltung von rekombinanten Proteinen aus Einschlusskörpern Wirkmechanismen: Aufbrechen von H-Brücken, Erhöhung der Löslichkeit hydrophober Reste
• Formulieren Sie die proteinchemische Nebenreaktion, die dabei zu befürchten ist.
• Durch welche beiden einfachen Maßnahmen kann man diese verhindern? ·         pH-Wert erniedrigen, sodass Lys zunehmends protoniert und damit weniger reaktiv vorliegt (nicht mehr als Nukleophil) ·         Ammonium zum Puffer geben, damit sich das Ggw. auf Seiten des Harnstoffs verschiebt
• Benennen und formulieren Sie ein alternatives Reagens, das sich diesbezüglich stabiler verhält. Guanidinium-Chlorid
• Formulieren Sie die Reduktion einer Disulfidbindung in einem Protein durch DTT unter Benennung aller auftretenden Zwischenprodukte. Red. DTT                                                            gemischtes Disulfid                        oxidiertes DTT
• Wie nennt man diese Reaktion? Quasi-Einschritt-Reduktion
• Weshalb ist gerade DTT ein so effizientes Reduktionsmittel? Entropische Stabilisierung des Produkts aufgrund der energetisch günstigen Zyklisierung → oxidierte Form von DTT ist energetisch stark begünstigt.
• Benennen Sie zwei alternative Reduktionsmittel mit ihren Formeln und geben Sie dazu jeweils in einem kurzen Begriff einen Vor- oder Nachteil an. ·         β-Mercaptoethanol: zweistufige Gleichgewichtsreaktion, daher Überschuß notwendig ·         Tris-carboxylethyl-phosphin (TCEP): selektive Reaktion bei pH 5, nicht flüchtig, stabil gegen Luftoxidation  
• Formulieren und benennen Sie das Reagenz, welches zur Quantifizierung von freien Thiolresten allgemein gebräuchlich ist. Dithiobisnitrobenzoat (DTNB, Ellman’s Reagent):  
• Formulieren Sie die Aktivierung von Biotin (unter Vernachlässigung der Stereochemie) mit EDC als NHS-Ester und dessen regioselektive Kopplung mit der Lysinseitenkette eines Proteins.
• Welche chemische Gruppe (mit Formel) ist dagegen zur regioselektiven Markierung von Cysteinseitenketten allgemein gebräuchlich? N-Ethylmaleimid: Ersatz der Ethylgruppe durch z.B. Fluorescein, PEG
• Beschreiben Sie mit jeweils maximal 5 Sätzen die wesentlichen Charakteristika (a) einer α-Helix und (b) eines β-Faltblatts. a)      H-Brücke zwischen C=O ASi mit N-H von ASi+4 (linear, parallel zur Helixachse)→ Nahordnung 5,4 Å pro Windung, statistische Präferenzen für einzelne AS, Ala hat stärkste Tendenz zur Ausbildung eine Helix, Pro stört die Geometrie (Helixbrecher), an Cβ verzweigte AS sind weniger günstig, da nur eine Seitenkettenkonformation erlaubt ist 3,6 AS pro Windung, Φ -57°, Ψ -47°, ω 180° b)      Basiseinheit β-Strang, Anordnung der einzelnen Stränge parallel oder antiparallel (stabiler) mit H-Brücken-Netzwerk dazwischen, natürliche β-Faltblätter sind verdrillt → in der Primärstruktur entfernte AS werden räumlich zusammengebracht → Fernordnung 2 AS pro Windung
• Was ist der fundamentale Unterschied zwischen beiden, der vor allem für die Strukturvorhersage eine Rolle spielt? Nah- bzw Fernordnung: Reste, die die α-Helix ausbilden sind auch in der Aminosäuresequenz nach beieinander; Reste, die β-Faltblätter ausbilden können hingegen in der Primärstruktur sehr weit auseinander liegen.
• Welche elektrostatische Besonderheit ergibt sich bei einer α-Helix? Parallele Ausrichtung der Peptidgruppen → Makro-Dipolmoment: entsprechend 0,5 – 0,7 Elementarladungen an den Enden (N-Terminus positiv)
• Wie heißen zwei andere, allerdings wesentlich seltenere Helix-Typen? 310-Helix, π-Helix, Collagen-Tripelhelix
• Nennen Sie jeweils ein Protein, das praktisch ausschließlich die ein oder andere Form enthält. All α Proteine: Serumalbumin, Glucoamylase All β Proteine: Lectin, CD8
• Vergleichen Sie die beiden hydrophoben Aminosäuren Leucin und Methionin anhand ihrer chemischen Strukturformeln. Wenn Sie beim Engineering der hydrophoben Kernregion eines Proteins aufgrund der ähnlichen Raumausfüllung die Wahl zwischen beiden hät ·         Met: hohe Flexibilität der linearen Seitenkette (→Anpassungsmöglichkeit an sterische Randbedingungen) ·         Leu: verzweigte Struktur, stabilisiert durch spezifische hydrophobe Wechselwirkung
• Welche der beiden Aminosäuren ist chemisch instabiler und weshalb? Methionin ist instabiler wegen unverzweigter Struktur; Flexibilität der Seitenkette liefert einen entropisch ungünstigen Beitrag zur Proteinfaltung S ist reaktiver als die Methylgruppe des Leucins
• Wie heißt eine Aminosäure mit der gleichen Masse wie Leu, und was ist deren strukturelle Besonderheit? Isoleucin: besitzt ein zweites chirales Zentrum
• Erklären Sie folgende Begriffe in jeweils maximal zwei Sätzen: (a) Öltropfen-Modell (b) Effektive Konzentration (a) Öltropfen-Modell Zusammenlagerung unpolarer Moleküle in Wasser und wässrigen Lösungen, da Wassermoleküle in der direkten Nachbarschaft keine H-Brücken zu unpolaren Molekülen ausbilden können und sich so untereinander etwas stärker binden. → Hydrophober Effekt   (b) Effektive Konzentration Quotient aus Kintra und Kinter:        
• Freie Transferenergie Energieunterschied des Wechsels von einem Medium in das andere z.B. von purem Wasser in die Lösung des Ko-Solvens in Wasser des Proteins  
• β-Meander
• Coiled Coil 2 α-Helices, die sich aneinander winden; 3,5 Reste pro Windung → Heptadmotive
• Framework Model hypothetischer Faltungsmechanismus mit Intermediat ·         Bildung lokaler Elemente von nativer Sekundärstruktur ·         daraus Enstehung der nativen Tertiärstruktur durch Diffusion/Collision
• Halbwertskonzentration Konzentration, die die Anfangsgeschwindigkeit einer Reaktion auf die Hälfte herabsetzt
• Chevron-Plot Abhängigkeit der Geschwindigkeitskonstante der Faltung bzw Entfaltung eines Proteins von der Denaturierungsmittelkonzentration
• Acyl-Enzym-Ziwschenprodukt Stadium bei der Hydrolyse einer Peptidbindung (katalytische Triade): Serin im aktiven Zentrum verbunden mit Carboxyterminus der gespaltenen Peptidbindung, Aminogruppe ist bereits abgespalten
• Substrate-assisted Catalysis Funktionelle Gruppe eines Substrates trägt zur Katalyse durch ein Enzym bei

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