Molekulare Bakteriengenetik (Fach) / Lernhilfe N Bacterial Genomics (Lektion)

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• Wie kann man feststellen, ob zwei Plasmide der gleichen Inkompatibilitätsgruppe angehören? Inkompatibilität: Inc-Gruppe = KontrollmechanismusWenn zwei Plasmide der gleichen Inkompatibilitätsgruppe angehören, heißt das, dass sie gleich repliziertwerden, es kann also keine Unterscheidung zwischen den einzelnen Plasmiden bei der Replikation erfolgen Kontrolle nur über KopienzahlVersuch:1. Beide Plasmide in Zelle Trafo beider Plasmide in eine Zelle (jedes Plasmid mit unterschiedlicher Resistenz) und Selektionder Bakterien mit beiden Plasmiden über Antibiotika-Medien Inkubation der Trafo-Bakterien ohne Antibiotikum und ausplattieren auf zwei verschiedene Agars mitjeweils einem Antibiotikum  Kolonienzahl bestimmen2. Je ein Plasmid in Zelle Experiment wie oben, nur mit jeweils einem Plasmid Wenn Kolonienzahl mit beiden Plasmiden in Zelle auf den Medien geringer ist, heißt das, dass diePlasmide inkompatibel sind (der gleichen Inc-Gruppe angehören)  Verlust eines Plasmidswahrscheinlicher durch gleiche Replikationsmechanismen
• 2. Welche Bedingungen muss ein broad host-range Plasmid erfüllen? broad host-range= weites Wirtsspektrum der Plasmide, zum Beispiel RK2 und RSF1010 sowie rolling-circlePlasmide aus gram negativen Bakterien Müssen alle eigenen Proteine zur Initiation der Replikation dekodieren können und diese Gene inverschiedenen Bakterienstämmen exprimieren können  die Replikation des Plasmids musskomplett unabhängig von DNA-Replikation des Wirtes sein Die Promotor und Ribosom initation site von Replikationsgene von Plasmiden mit weitenWirtsspektren müssen von einer Vielzahl von Bakterien erkannt werden können
• 3. Nennen Sie Beispiele, wie Inkompatibilitätsgruppen entstehen können. bei gegenseitiger Regulation der Replikation bei gleicher par-Funktion der Plasmide leichte Veränderungen im Mechanismus der DNA-Replikation (Veränderung der Kontrollelementeder Replikation), z.B. durch Veränderungen in der RNA I, im ori-spezifischen Rep-Protein(Initiationsprotein, im Plasmid codiert)
• 4. Wie können Sie feststellen, ob E. coli-Wirtsproteine wie DnaB oder DnaC für die Replikation eines von Ihnen gefundenen Plasmids notwendig sind?  DnaB = Helicase  Entspiralisiert die Doppelhelix an der Replikationsgabel DnaC= Helicaseloader  Lädt die Helicase auf den Replikationsursprung Vorgehen:o Knock-out der RNA Gene für DnaB und/oder DnaC in Mutante  Selektion durch Resistenzauf Plasmido Kein Wachstum: keine Plasmid-Replikation (DnaB/DnaC-abhängig)o Zweite Mutante mit Plasmid und zusätzlichem Plasmid anderer Inc-Gruppe, das DnaB/od.DnaC codiert  Wachstum sollte nun auf Antibiotika-Medium möglich sein
• 5. Warum befinden sich viele der an der Plasmidregulation beteiligten Gene nicht auf dem Plasmid, sondern auf dem Chromosom des Wirtes? Nennen Sie Vor- und Nachteile. Größe der Plasmide begrenzt  Platz auf Plasmid für Resistenzgene benötigt, die das Überleben derPlasmide sichern sollen  Integration erfolgt über F-Plasmid (Hfr-Stämme) Nachteile:o Plasmid-Klonierung ist außerhalb des Genoms schnellero Plasmid-Replikation ist vollständig vom Wirt abhängigo keine Plasmid-Replikation bei Inkompatibilität der Gene und der vorhandenen Mechanismenund somit kleineres Wirtsspektrum Vorteile:o genomische DNA ist stabilero bei frühzeitiger Teilung und dabei noch unvollständiger Klonierung des Plasmids istInformationsverlust weniger wahrscheinlicho kleine Plasmidgröße (bessere Übertragung)
• 6. Ein Hfr-Stamm, der prototroph für His und Trp, aber auxotroph für Arg ist, wird mit einem Rezipienten, der Arg-prototroph, aber His und Trp auxotroph ist, gekreuzt. Die Stämme werden anschließend auf Minimalmedium mit Histidin und Arginin, aber ohne Tryptophan ausplattiert. Was ist selektionierter Marker, was nicht-selektionierter Marker?  Hfr-Stamm = Donor  kann His und Trp selber synthetisieren, benötigt Arg Rezipient  synthetisiert Arg selber, braucht His und Trp  benötigt Gen für His über Konjugation Minimalmedium enthält His und Arg KEIN Trpo Trp ist selektionierte Marker, da im nicht im Mediumo His und Arg sind nicht selektionierte Marker (liegt beides im Medium vor und wird vonRezipient benötigt)
• 7. Warum hat sich natürliche Kompetenz entwickelt? Was sind die Vor- und Nachteile? Natürliche Kompetenz: im Genom dieser Bakterien spezielle Gene, deren Genprodukte für die Erkennungvon DNA, deren Aufnahme in die Zelle und Integration durch Rekombination in das Genom verantwortlichsind ( com-Gene). Normalerweise wird Kompetenz künstlich hergestellt z.B. durch Hitze oder Chemikalien Vorteile:o Reparatur mutierter DNA-Abschnitteo Fremdgene mit evolutionärem Vorteil (Rekombination), z.B. Herstellung einer bestimmtenASo C-/N-Quelle Nachteile:o Poren zum Eindirngen der DNA in die Zelle  erhöhtes Risiko von Viren-/Erregerbefallo Inkompatibilität der aufgenommenen DNA führt zu nicht funktionellen/mutierten Genen bzw.Verlust von Fähigkeiteno Extra Gene zur Porensynthese nötig (Energie-/Stoffverbrauch)
• 8. Warum sind die tra Gene gewöhnlich in unmittelbarer Nachbarschaft zum oriT?  Tra-Gen = Transfer-Gene  können sich durch Konjugation sowohl zwischen bakteriellen Speziesaber auch innerhalb eines Bakteriums von einem zum anderen Ort bewegen  mpf-/dtr-Gene fürSelbstübertragbarkeit tra-Gene für die Konjugation zuständig und werden durch ihre Lage in der Nähe des oriT mit hoherWahrscheinlichkeit auf den Rezipienten übertragen, der dann auch fähig ist DNA auf andere Zellenzu übertragen. tra-Gene codieren den Kontaktpilus, der OriT ist für den Beginn der Replikation des übertragenen FPlasmidsmittels des „Rolling-Circle“-Mechanismus verantwortlich.
• 9. Wie würden Sie zeigen, dass nur ein Strang des Plasmids bei der Konjugation in die Rezipientenzelle gelangt?  Verwendung eines Rezipienten mit Temperatur-sensitiver Mutation im Primase.Gen  Plasmid bleibtssDNA  Plasmid isolieren und über Gelelektrophorese aufreinigen Mendelson-Stahl-Experiment: Donor-Zelle in 15N-Medium bzw. Fluoreszenzmarkierten Nukleotidenanziehen
• 10. Sie fanden heraus, dass eine Tetrazyklin-Resistenz übertragen wurde. Wie können Sie unterscheiden, ob dieser Transfer durch ein konjugierbares Plasmid oder ein konjugatives Transposon erfolgte?  Konjugierbares Plasmid= enthält das tra-Gen, das die Konjugation, den parasexuellen Austauschvon Plasmiden zwischen zwei Bakterien auslösen kann Konjugatives Transposon= Konjugative Transposons sind weitere bekannte DNA Elemente, die dieFähigkeitbesitzen, zwischen Chromosomen von verschiedenen Zellen zu translozieren Elemente kodieren meist Antibiotikaresistenzgene und die Funktionen zum Herausschneiden desTransposons aus dem Donorchromosom, sowie zum Transfer und Einbau in andere Zellen. Übertragung über Plasmid: Vorliegen des Plasmids in der Zelle (integriert/nicht integriert) Aufreinigen und Sequenzierung Gelelektrophorese (Bande bei nicht integriertem Plasmid) Übertragung durch Transposons: kein Plasmid und i.d.R. nicht eindeutig nachzuweisen, wo dasResistenzgen integriet wurde (auch: keine Lokalisiserung durch Springen des Transposons) Aufreinigen und Sequenzierung (kein Plasmidbande!) Nachweis der veränderten flankierenden Sequenz des Transposons
• 11. Gegen welche pathogenen Bakterien bietet sich eine Phagentherapie an? aufgrund der limitierenden Diffusionskapazität und Verteilung v.a. für atropische Anwendung (= aufOberfläche) und nur bedingt bei invasiven Organismen (oft: prophylaktische Anwendung) Wundinfektionen  Staphylococcus, Pseudomonas, Acinetobacer Herz- oder Hirnhautentzündungen  Entereococcus Lungeninfektionen  Klebsiella, Streptococcus, Pseudomonas Darminfektionen  Shigella, E. coli, Vibrio
• 12. Was sind die Nachteile einer Phagentherapie? Eingeschränktes Wirtsspektrum bei akuten Infektionen und unbekannter Ursache  Phagenpoolverwenden/ Wirtsspektrum verändern durch gezielte/zufällige Mutation der Schwanzfiber-Adhäsine Häufig erfolgt Inaktivierung der Phagen durch körpereigene Systeme Bildung von Anti-Phagen Antikörper Resistenzentwicklung bei Aufnahme durch Bakterien bzw. nach Aufnahme der Phagen keine Lyse derBakterien und somit keine Freisetzung weiterer Phagen  Kombinationstherapie mit Antibiotika Lysogene Phagen  Einbau von DNA in Genom, Prophagen können nicht mehr von anderen Phagenbefallen werden, außerdem keine Lyse der Bakterien; Zusätzlich kann eine Übertragung von Toxinenoder Pathogenitätsfaktoren auf Wirtszelle stattfinden Freisetzung von Zellbestandteilen durch Lyse  Toxine od. Endotoxine (Bestandteil der äußerenMembran gram-negativer Bakterien) unreine Präparation, heute kein Problem mehr (Aufreinigungsmethoden stark verbessert)
• 13. Welche experimentellen Anwendungen von Transduktion gibt es? DNA Übertragung von einer zu anderen Zelle mit Hilfe eines Bakteriophagen Allgemeine Transduktion  es kann praktisch jedes Gen auf dem Donor-Chromosom zum Empfängertransferiert werden Spazialisierte Transduktion  nur bestimmte Gene, die nahe zu den Stellen liegen, an die sich der Phageanlagert, werden übertragen Transduktion bestimmter Genen in Nutzpflanzen Herstellung Rekombinanter Proteine (Einbringung meist in E. coli) Herstellung von RNA-Fragmenten als Phage Display virale Vektoren
• 14. Warum kodieren viele Phagen ihren eigene replikativen Apparat?  Um Unabhängigkeit von der Wirtszelle sicherzustellen, dadurch breiteres Wirtsspektrum Damit zwischen rolling circle und theta Replikation gewechselt werden kann (beide Möglichkeitenvorhanden) Zeitersparnis
• 15. Warum sind lysogene Zellen immun gegenüber einer Superinfektion? (biologischer Grund und molekularer Mechanismus) Die Vermehrung des Prophagen erfolgt stets koordiniert mit derVerdoppelung des Bakteriengenoms (lysogener Zyklus). Bakterienzellen, dieeinen Prophagen enthalten, sind resistent gegenüber erneuter Infektion(Superinfektion) durch weitere Phagen, da die Integrationsstelle im Genom(attB site) durch das Einfügen verändert ist. Änderung der äußerenBedingungen mit z.B. bestimmten Chemikalien lösen die Aktivierung derProphagen aus. Er wird aus dem Bakteriengenom ausgeschnitten und dieSynthese neuer Phagenpartikel beginnt, was schließlich zur Lyse derBakterienzellen führt.CI Repressor in der Zelle verhindert, dass Transkription von anderenProphagen erfolgen kann (sind keine bzw. werden keine Prophagen in derZelle gebildet so gibt es das entgegengesetzte Signal und es kommt zurSuperinfektion)
• 16. Welche Gründe könnte es geben, dass Toxine und andere Faktoren, die zur Pathogenität von Bakterien beitragen, von Phagen kodiert werden? Befall des Bakteriums führt zur Übertragung von Pathogenitätsfaktoren (durch Einbau der DNA in dasGenom) Sicherstellen der optimalen Vermehrung und Verbreitung des Bakteriums und somit dieVerfügbarkeit des Bakteriums als Wirtszelle für den Phagen (Vermehrung und Verbreitung desPhagen)  meist Genome zwischen 20 kb und 150 kb als potentielle Gefahr genetische Modifikation Verwendung von virulenten Phagen (auch: breiteres Wirtsspektrum)
• 17. An welchen Schlüsselstellen der Phagenreplikation spielt Antitermination eine Rolle? Antitermination = Gen wird bis zum ersten Terminator abgelesen  Antiterminationsprotein heftet sich an undes erfolgt kein Abbruch der Translation sondern direkt Ablesen des zweiten, daurauffolgenden Gens Der Lamnda-Phage reguliert seine frühe Transkription durch zwei Antiterminationsproteine, N und Q Proteine binden an die RNA Polymerase und erlauben eine Transkription über die Transkriptions-Terminator-Stelle hinweg N-Protein: das N-Protein bindet in einer Falte der mRNA, die sich während der Synthese an spezifischenStellen bildet  sehr früh im Zyklus und zur Synthese von Rekombinations- und Replikationsfunktionen Q-Protein: bindet zunächst an die DNA. Es verharrt dort solange, bis die RNA-Polymerase diesenStrangabschnitt passiert und es zu einem Kontakt zwischen Protein und Polymerase kommt  sehr spätim Zyklus und zur Synthese später Strukturproteine (Kopf/Schwanz)
• 18. Welche Rolle spielt das Cro-Protein? Ist eines der ersten Proteine, das nach der Induktion repliziert wird (gehört zur Gruppe der „frühen“Proteine). Verhindert die Synthese von Repressor-Molekülen (CI) und sorgt somit für eine sehr schnelle undeffiziente Replikation. Bindet Cro an den Operator, so kann CI nicht mehr dort binden und seine eigene Syntheseaktivieren Hemmung von CI und somit des lysogenen Zyklus über CII und CIII aktiviert lytischen Zyklus undReplikation (Synthese von O- und P-Produkten)
• 19. Welchen Vorteil hat es, lysogene Phagen als Klonierungsvektor zu verwenden?  Phagengenom liegt zunächst inaktiv in der Prophagensituation vor  Aktivierung erfolgt über Stress  istinduzierbar und daher (zumindestens mäßig) steuerbar Der Wirt wird nicht lysiert, sondern durch Vermehrung erhalten alle Wirtszellen die Vektor-DNA kloniertes Gen liegt sicher nur 1x in der Zelle vor
• 20. Sie haben einen Phagen von Staphylococcus aureus isoliert. Dieser Stamm vergiftet Lebensmittel aufgrund von Toxinproduktion. Seine toxische Wirkung kann durch Zellkulturexperimente belegt werden. Wie können Sie nachweisen, dass das Toxin durch einen Phagen von S. aureus kodiert wird? Prophagen induzieren durch Stress (z.B. UV-Licht) Selektionsmarker (z.B. Resistenz) in Prophage  Zellen können nach UV-Bestrahlung selektioniertwerden  „Ausbau“ des Prophagen durch Übergang in lytischen Zyklus  Selektion aufPhagentragende ZellenTest auf Toxinproduktion mit Plaques-Test: gefilterter Überstand der selektionierten Zellen werden aufhumane Zellkultur gegeben  Plaquebildung
• 21. Wie können Transposons natürlicherweise zwischen Bakterien übertragen werden?  Cut and paste Mechanismus  nicht replikative Transposition:o An der Donor DNA wird zunächst an beiden Enden des Transposons ein Doppelstrangbrucherzeugt, das Transposon wird aus der DNA ausgeschnitten.o An der Donor DNA wird ein Doppelstrangbruch mit überlappenden Enden erzeugt.o Ligation der Transposon Enden mit der Empfänger DNA, die noch fehlenden Basen werdenergänzt Replikative Transpositiono Zunächst werden durch die Transposase an beiden Kreuzungen zwischen Transposon undDonor Strang Einzelstrang Brücke erzeugt. In der Empfänger DNA wird ein Doppelstrangbrucherzeugt. (So liegen dann zwei 5’ und zwei 3’ Enden auf dem Empfänger Strang und ein 5’ undein 3’ Ende am Transposon vor.)o Der Doppelstrangbruch wird so verschoben, dass die Nicks auf beiden Seiten gleich viele Basenaus einander liegen wie nachher bei der Insertion wieder verdoppelt werden.o Das 5’ Ende der Empfänger DNA wird nun mit dem 3’ Ende des Transposons ligiert. Nun sindbeide DNA Moleküle zu einem verbunden, das in der Mitte teilweise Einzelstränge trägt.o In beide Richtungen wird nun repliziert, wobei die 3’ Enden als Primer dienen.o Als letzten Schritt wird nun die „Cointegration“ gelöst. Die „Trennung“ der Stränge gelingtdadurch, dass die auf dem Transposon und nun auf beiden Strängen vorhandenen res sitesrekombinieren (crossover) und die „8-Figur“ so in zwei getrennte Teile auflösen.
• 22. Wie kann man experimentell zwischen cut & paste und replikativer Transposition unterscheiden?  Blau-Weiß-Selektion über β-Galactosidase: X-Gal Zwei Allele (wt  färbt Kolonien, mut  keine Färbung) mit einem Gen werden kombiniert (Aufschmelzen) 3 Kombinationen möglich: aa, ab, bb Überführen auf Transposons mit Antibiotikaresistenz (Selektionsmarker für erfolgreiches Springen desTransposons) in Phagen und dann in Bakterien  einmaliges Vorgehen! bei replikativer Transposition entstehen nur einfarbige (farbig oder farblos) Kolonien, da nur ein Allelweitergegeben wird (selbst bei Heterologie des Gens mit wt/mut)  durch Degradation der Donor-DNAgeht anderes Allel verloren gemischte Kolonien auf der Platte (zweigeteilt) sind ein Indikator für die nicht replikative Transposition(copy and paste), da BEIDE Allele übertragen werden (bei Heterologie des Gens)  durch Zellteilungwird allerdings bei der 1. Zellteilung nur ein Allel weiter vererbt (wieder Homologie des Gens inNachfolge-Generationen) und somit farbliche Zweiteilung der Kolonie
• 23. Welche Vorteile/ Nachteile bringen Transposons ihren Wirten?  Nachteile:o können letale Mutationen durch ungünstiges Springen (knock-out essentieller Gene)o polare Mutation: Ausschalten eines ganzen Operons Vorteil:o Resistenzeno Generell vorteilhafte Mutationeno Selektionsvorteil durch positive Rearrangements (Inversion, Deletion, Translokations,Duplikation)
• 24. Wie stellen Sie fest, ob ein neu entdecktes Transposon zufällig ins Chromosom inseriert?  Southern Blot Analyse Erkennung einer Sequenz im Transposon Isolation mehrere Bakterienstämme (DNA) mit unabhängigen Transposon-Insertionen DNA-Verdau mit Restriktionsenzym ohne Schnittstelle im Transposon Wenn die Fragmente unterschiedlich lang sind  ZUFÄLLIGE INTEGRATION (unspezifischeTransposition)
• 25. Wie können Sie zeigen, dass der Mu-Phage/ das Mu Transposon keine Resolvase besitzt?  Plasmid mit zwei Kopien des Mu-Phagen designed durch Klonierung eines Stücks, das Mu-Tn enthält ineinen Klonierungsvektor, der bereits Mu-Tn trägt Wenn diese zwei wiederholten Mu Elemente sich lösen können ohne Rekombinationfunktion des Wirts,enthalten sie codierende Sequenzen für Resolvase. Die sogenannte Tn3-Familie besitzt neben der Transposase auch eine Resolvase (tnpR) und enthälteine sogenannte "res-Site". Transposasen der Tn3-Familie schneiden im Gegensatz zu denen der ISElementenicht zwingend an den eigenen IR, sondern auch an entfernteren IR der gleichen Familie.Dadurch wird ein großes Stück Wirts-DNA eingeschlossen (Kointegrat), das durch die Resolvase in derres-Site herausgeschnitten wird. (WIKIPEDIA)
• 26. Sie haben einen Pseudomonas-Stamm isoliert, der auf dem Herbizid 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure als einziger Kohlenstoff- und Energiequelle wachsen kann. Wie würden Sie die Gene für diesen Herbizid-Abbau mittels Transposon-Mutagenese klonieren?  Verwendung eines selbst-übertragbaren Plasmids, um Tn5 (mit Kan-Resistenz) in den Pseudomonas-Stamm zu bringen Auswahl der Transkonjugation über Kanamycin  Abdruck auf Platte mit 2,4-D  Klone mit Tn-Insertion indie entsprechenden Gene können nicht wachsen und können selektiert werden (Klone von Kan-Plattepicken und DNA isolieren) Verdau mit Restriktionsenzymen, die nur außerhalb von Tn5 schneiden Ligation der Fragmente in Klonierungsvektor und Trafo in E. Coli  Selektion über Kann alle Klone die Plasmid mit Tn5 enthalten, können wachsen
• 27. Welche Nachteile/ Vorteile hat Transposon-Mutagenese gegenüber chemischer Mutagenese? Vorteile: fast immer Inaktivierung des Gens  Phänotyp von knock-out klar erkennbar Markierung der Mutationsstelle durch das Tn große Genstücke können transportiert werden, Gen-Kassetten;Nachteile: nur Untersuchung der Inaktivierung, nicht z.B. AS-Austausch, keine Unterscheidung bei Mutation in essentiellen Genen, da gleich letaler Verlauf
• 28. Wodurch zeichnet sich der Phage Mu aus?  temperenter Phage inseriert völlig ungerichtet  schnell viele verschiedene Mutationen über replikative UND nicht replikative Mechanismen „großes Transposon“
• 29. Welche Vorteile bieten Cosmid-Banken?  Cosmid = Plasmid mit cos-sites  kann in lambda-Phage verpackt werden Vorteile:o in vitro packagingo limitierte Größe der verpackten DNA  immer gleicher Abstand der cos-sites und somit verpackteDNA immer etwa gleich groß ( wichtig bei Genbibliotheken)o Klonierungskapazität von Cosmiden größer ist als die von Plasmiden
• 30. Wie identifizieren Sie den Ort einer Transposition?  DNA isolieren und mit Restriktionsendonukleasen schneiden, die nur außerhalb des Transposonsschneiden Fragmente mit Tn über Tn-spezifischen Southern-Blot identifizieren und anschließend Sequenzieren
• 31. Welche Bakterien/Enzyme werden zum Betreiben einer Biogasanlage benötigt? Welche zur Herstellung von Industriealkohl aus Stärke?  Biogasanlage:o Hydrolasen: Spaltung von organischen Stoffen wie Kohlenhydrate, Fette, Eiweiß) -> Verwendungvon Amylasen, Proteasen, Lipaseno Vergärung und Säurebildung: säurebildende Mikroorganismen; Lactobacillus, Staphylococcuso Acetogenese: acetogene Mikroorganismen z.B. Clostridieno Methanogenes: Methanbilder (Archaen) Industriealkohol: Saccharomyces, Klebsiella (Butandiol), Zymomonas (Ethanol)
• 32. Sie nutzen die blau/weiß- Selektion für eine Klonierung. Sie stellen fest, dass auch einige der blauen Klone Inserts tragen. Warum? Generell beruht die blau/weiß Selektion auf der Aktivität der beta-Galactosidase -> wenn das Enzym aktivist, kann es X-Gal umsetzten und es kommt zu einer signifikanten Blaufärbung -> Chromosom besteht auszwei Untereinheiten, eine sitzt auf dem Chromosom, eine auf dem Plasmid -> nur wenn beides in der Zelleist, kann Aktivierung und somit Färbung erfolgen Es kann zur Färbung kommen wenn unspezifisch einer Aufnahme kommt die Transposon mit Enzymträgt MutationAus Fragenkatalog:o Das lacZ-Gen kodiert normalerweise für gamma-Galactosidase  Lactosespaltungo Auf dem Plasmid ist das Gen für die Omega-Untereinheit der Galactosidase  kann alleine Lactose nichtspalten  Weiße Kolonieno Auf dem eingeführten Vektor befindet sich das Gen, das für das alpha-Fragment kodiert, kann alleineauch keine Lactose spalten  Weiße Kolonieno Werden sowohl alpha- als auch omega-Untereinheit exprimiert, kommt ein funktionsfähiges Enzymzustande und IPTG kann umgesetzt werden Kolonien werden blauo Bakterien müssen wohl 2 Plasmide aufgenommen haben
• 33. Welche Nachteile hat die Verwendung der luxAB-Kassette? Lux Kassette beinhaltet das luxA und das luxB Gen -> beide zusammen sind verantwortlich für dieGenerierung eines Lichtsignals -> für die vollständige Aktivierung des Lichtsignals muss ein Bioreportereingebracht werden Wird kein Bioreporter in die Zelle eingebracht, kommt es nicht zur vollständigen Aktivierung derKassette Lux in Phagengenom liegt hinter einem stark exprimierten Gen, dem Haupt-Kapsidprotein ->Bioreporter ist in Phagen also das Kapsid -> das Leuchten erfolgt jedoch nur so lange, bis dasKapsid eingebaut wird -> erfolgt relativ schnell, daher nur kurzes Leuchten
• 34. Welche Voraussetzung für homologe Rekombination kennen sie?  Homologe DNA-Moleküle befinden sich in räumlicher Nähe Identische oder ähnliche Sequenzen müssen in den crossover-Regionen vorliegen Es müssen alle für die Rekombination benötigten Enzyme und Proteine rekrutierbar und prinzipiellvorhanden sein Es muss eine heteroduplex Formation erfolgen können
• 35. Welche Modellle zur homologen Rekombination kennen Sie?  Holliday double-strand inversion single strand inversion = Meselson-Modell Doble-strand break repair model = Stahl Modell
• 36. Was ist illegitime Rekombination? = nicht homologe Rekombination -> Integration experimentell übertragener Transgene kann durchnichthomologe (illegitime) Rekombination mit der chromosomalen DNA, d.h. an einer zufälligen Stelle desGenoms erfolgen. Enthält ein Transgen spezielle DNA-Sequenzen, die auch in einem Wirtsgenomvorhanden sind, ist seine Integration durch homologe (legitime) Rekombination möglich. Es kommt im Vergleich zu den Ausgangsmolekülen zu Veränderungen in der Basenabfolge. Die nach derRekombination codierte biologische Information unterscheidet sich deshalb von der ursprünglich codiertenInformation, der Vorgang ist mutagen
• 37. Warum besitzen praktisch alle Organismen Rekombinationssysteme? Rekombinationssysteme dienen der genetischen Vielfalt und Variabilität -> Veränderung an neuebiologische Bedingungen daher grundsätzlich (statistisch zufällig) möglich. Dienen der Überlebenssicherungin Form von DNA-Reperaturmechanismen, da sonst stark mutierete Zellen an Nachkommen abgegeben undeigenen Zellen schneller untergehen würden.
• 37. Warum besitzen praktisch alle Organismen Rekombinationssysteme? Rekombinationssysteme dienen der genetischen Vielfalt und Variabilität -> Veränderung an neuebiologische Bedingungen daher grundsätzlich (statistisch zufällig) möglich. Dienen der Überlebenssicherungin Form von DNA-Reperaturmechanismen, da sonst stark mutierete Zellen an Nachkommen abgegeben undeigenen Zellen schneller untergehen würden.
• 38. Warum kodieren machen Phagen ihr eigenes Rekombinationssystem und verlassen sich nicht auf den Wirt?  Schnellere Rekombination -> erhöhte Rekombinationsrate Größere Variabilität Keine Abhängigkeit von Wirt und äußeren Bedingungen Inhibierung des Wirtes möglich
• 39. Nennen sie Namen und Funktion der an Rekombinationsvorgängen beteiligten Enzyme A. Exonuclease (von 3’—> 5’): bildet Chi(Kreuz-) KomplexB. Endunuclease (von 5’—> 3’): baut DNA abC. ATPase: Erzeugt die benötigte Energie in Form von ATP durch HydrolyseD. Helicase: löst die Doppelstrangbindung aufE. Ligsase: Verknüpfung der neuen Elemente
• 40. Was haben Replikation, Rekombination und Reparatur gemeinsam?  Bei Zerstörung von DNA wird eine andere Art der Replikationsinitiation gebraucht, dieRekombinationsfunktionen erfordert. Rekombinationsmechanismen, die bei Start einer Replikationsgabel eine Rolle spielen
• 41. Eine einzige Inversion kann die Reihenfolge von Genen deutlich verändern. Warum sind sich dann die Genmappen von E. coli und Salmonella so ähnlich? ?
• 42. Warum werden Genduplikationen nicht wieder durch Rekombination zerstört? Duplikationen würden es erlauben die Genzahl eines Organismus zu erhöhen. Wenn die duplizierten Genedann mutieren, könnten sie neue Funktionen annehmen. Dementsprechend hätten manche Organismeneinen Selektionsvorteil und die Duplikation würde sich durchsetzen.
• 43. Was sind Vorteile, was sind Nachteile der Lamda-Rekombinase gestützten Deletionsmethoden?  Vorteile: Man bekommt ein komplett inaktiviertes Gen und die Methode ist gut auf spezifische Geneanwendbar. Nachteil: Man kann keine Abstufungen messen, sondern nur eine komplette Deletion.44.
• 44. Warum müssen sie Mutanten aus unterschiedlichen Kulturen isolieren, damit sie mit hoher Wahrscheinlichkeit unabhängige Mutation haben? Wenn man Individuen aus der gleichen Kultur isoliert, könnten sie „Geschwister“ sein und die gleicheMutation tragen, somit ist dies nicht representativ für die Gesamtheit aller Mutationen (nicht unabhängig).
• 45. Warum müssen Organismen notwendigerweise Rekombinationssysteme besitzen?  „speed up revolution“ Neue genetische Variation DNA-Reparatur
• 46. Welche Gründe können Genomreduktion bei obligat intrazellulären Bakterien verursachen? Obligat intracelluläre Bakterien sind meist humanpathogene Bakterien, die nicht ohne eine Wirtszelleüberleben können, diese aber durch eine Infektion schwächen. auf spezifische aufgaben reduziert, verlust der anderen gene, da zelle schon stoffe synthetisiert oder aufnimmt. kleineres genom --> weniger energie für replikation. stabilität der gene durch geringe variabilität (keine rekobinationsgene)
• 47. Optimieren sie die Definition eines Gens. Ein Gen ist eine Erbeinheit, die im Phänotyp manifestiert ist. Pro Gen gibt es ein Expressionsprodukt.Ein Gen besteht aus einer regulatorischen Sequenz (Promotor), einer UTR (untranslated region), demTranskriptionsstart, der Shine-Dalgarno-Sequenz (Teil der Ribosomenbindungsstelle und Translationsstart),einer Ribosomenbindungsstelle, dem Startcodon ATG, darauf folgt die codierende Sequenz, an deren Endeist das Stoppcodon auf den der Transkriptionsterminator folgt.
• 48. Welche Verbesserungen der 454-Sequenzierung würden sie anstreben? Zu sequenzierendes DNA-Fragment liegt einsträngig als Matrize vor. Zusätzlich zum Primer wird einbestimmtes NTP gegeben.Für die Sequenzierung werden vier Enzyme verwendet, die das durch den Einbau entstehende PPi in einennachweisbaren Lichtblitz umwandeln: DNA-Polymerase, ATP-Sulfurylase, Apyrase und LuxAB.Wird das passende NTP zugegeben und eingebaut entsteht also ein Lichtblitz, bei zwei gleichen NTPhintereinander ein doppelt so intensiver Lichtblitz.Danach müssen die übrigen NTPs entfernt werden und ein neues NTP zugegeben. Spätestens nach demvierten NTP muss also eine Reaktion stattfinden.Dieses Verfahren ist zeitaufwändig, da nach jedem Schritt gereinigt werden muss, bevor der nächste Schrittmit einem anderen NTP stattfinden kann. Eine mögliche Optimierung wäre eine Unterscheidung desLichtblitzes je nach eingebautem NTP, damit alle vier NTP gleichzeitig zugegeben werden können und sodie Reinigungsschritte entfallen.
• 49. Was verstehen sie unter der Kolinearität, was unter der Syntenie einer Genomsequenz?  Kolinearität = Basenreihenfolge im DNA-Code entspricht der AS-Folge im Protein Synthenie = Gemeinsamkeiten in der Reihenfolge von Genen oder Gensegmenten auf verschiedenenchromosomalen Abschnitten beim Vergleich von Genomen zweier verschiedener biologischer Arten

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