Pharmakologie (Fach) / fe (Lektion)

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  • Geben Sie mindestens 2 Krankheiten an, bei denen die Regulation des NFkB-Weg gestört ist. -> Hodgkin Disease, Rheumatoide Arthritis, Asthma, Arteriosklerose, Alzheimer,Karzinome, Melanome
  • 3. In Tumorzellen wird… o Cetuximab als Wirkstoff eingesetzto aktiviertes Ras-GTP nicht wieder deaktiviert
  • Beschreiben Sie einen kompetitiven Immunoassay. Worin liegt der grundlegende Unterschied zum Sandwichassy? o IMMOLITE Cortisol Test zur quantitativen Messung von Cortisol im Serumo Ein kompetitives Immunoassay ist ein heterologes Assay, bei dem Antigen(Cortisol) aus einer Patientenprobe mit dem enzym-markierten Antigen um denBindungsplatz am Antikörper konkurriert. Es kommt zu einerLumineszenzreaktion, die anzeigt, wieviel Cortisol in der Probe vorhanden ist. Einhohes Signal bedeutet wenig Cortisol in der Probe, aber eine große Mengegebundene alkalische Phosphatase.o Sandwich-Assay: zur quantitativen Messung von intaktem Parathormon imSerum und EDTA Plasma (Messung für Diagnose der Hyper- & Hypokalzämieverwendet)o Beim Sandwich-Assay kommen zwei Antikörper zum Einsatz, die das ProbenAntigen zwischen sich „einklammern“. Der Detektions-Antikörper ist ebenfallsgegen das Antigen gerichtet und ist außerdem nicht mit einem Enzym markiert,sondern mit einer lumineszierenden Substanz.
  • Anwendung der Chemolumineszenzreaktion zum Nachweis von Proteinen nach der elektrophoretischen Auftrennung (Theorie mit Skizze) o Anwendung beim Western-Bloto HRP (horse radish peroxidase) katalysiert in Anwesenheit von H2O2 die Oxidationvon Luminol. Ein intermediäres Radikalkation reagiert unter N2- & Lichtabgabe zustabilem Aminophthalat. Enhancer (ECL – enhanced chemoluminescencereagent) erhöhen die Enzymaktivität und damit dieRadikalkationenkonzentration -> Belichtung
  • Beschreiben Sie die klassische Aktivierung des NFκB-Weges o NFkB im Cytosol inaktiv an IKB (Inhibitor) gebundeno nach Stimulation (Zytokine, Stress,…) wirde der IKB-Kinase-Komplex (IKK)aktiviert, der die Phosphorylierung von IKB bewirkto es kommt zur Ubiquitinierung von IKB und zum Abbau von Proteasomeno NFkB ist nicht mehr inaktiv und wandert in den Zellkern, setzt dort an der DNAan und reguliert die Transkription von Zielgeneno Aktivierung wenige Minuten nach der Stimulation
  • Erklären die Abkürzungen Ras, Raf, MEK, ERK, Elk. o Ras = rat sarcomao Raf = ras activation proteino MEK = mitogen-activating ERK-Kinaseo ERK = extrazellulär regulierte Kinaseo Elk = Transkriptionsfaktor
  • Beschreiben sie die Quantifizierung von Proteinen, wozu wird die Proteinbestimmung vor dem Auftragen der Proteinlysate benötigt? o Quantifizierung durch Gel-Elektrophorese (Auftrennung nach Molekulargewichtmit SDS)o für gleiche Proteinmengen bei der Elektrophorese, Quantifizierung durch „DCProtein Assay“ (Reduktion des Folin-Reagens)
  • Elektrophorese-prinzip und Vorgangsweise. o Auftrennung der Proteine nach Molekulargewicht in SDS-Acrylamidgel (für alleProteinklassen anwendbar)o Wanderung geladener Teilchen im elektrischen Feldo Herstellung eines „running-„ & eines „stacking-gels“o Kamm aufsetzen, Taschen mit running puffer waschen, MG-Gewichtsmarker undProben hinein pipettiereno Auftrennung der Proteine
  • Warum nehmen Cytochrome eine Schlüsselfunktion bei der Metabolisierung von Pharmaka ein? Welche Subfamilie stellt die wichtigste Gruppe der klinisch relevanten Cytochrome dar? o Hauptaufgabe: oxidativer Abbau von körpereigenen und körperfremden Stoffeno wichtigste Subfamilie: P450
  • . 4 Arzneistoffgruppen, die von CYP450 2D6 metabolisiert werden: o Betablockero Antiarrhythmikao Antidepressivao Opioideo Neuroleptikao Antihypertensiva
  • Wie werden CYP 2D6 Polymorphismen vererbt? Nennen sie molekulare Unterschiede für einen langsamen sowie einen ultraschnellen Metabolismus o sie werden autosomal rezessiv vererbt Æ d.h. es müssen beide Allele betroffen sein,damit kein CYP 2D6 exprimiert wirdo langsamer Metabolisierer: Mutation kommt auf beiden Allelen vor Æ Gen ist auf beidenAllelen inaktiviert Æ fehlende Enzymaktivität Æ extrem langsamer Metabolismus ÆNebenwirkungen, Toxizitäto ultraschneller Metabolisierer: stark erhöhte Aktivität aufgrund einer Genduplikation aufChromosom 22, wodurch CYP2D6-Substrate bei homozygoten Trägern extrem schnelleliminiert werden Æ gesteigerte Enzymaktivität Æ Arzneimittel unwirksam
  • Weshalb ist die PCR so wichtig? Prinzip der PCR? o Methode um die DNA in vitro zu vervielfältigeno DNA-Polymerase verwendeto genomische DNA wird auf Mutationen untersuchto Ausgangsmaterial sind weiße Blutzellen und andere kernhaltige Zellen (Haarwurzelzellen,Gewebeproben, Urin,…)o PCR vervielfältigt das spezifische DNA-Fragment, das den Polymorphismus enthälto exponentielle Amplifikationo Schritt 1: Denaturierung (Stränge bei 95°C getrennt)o Schritt 2: Primer-Annealing (forward-primer und reverse-primer binden komplementäran anti-sense-strand/sense-strand bei 55-64°C)o Schritt 3: Elongation, DNA-Synthese bei 72°C (DNA-Polymerase füllt die fehlendenStränge mit freien Nukleotiden auf in 3‘-5‘-Richtung)
  • Nennen sie 2 Krankheiten bei denen es auf Grund eines Polymorphismus zu starken AM-Nebenwirkungen kommen kann. o Genvariation spielt bei der Behandlung eine wichtige Rolleo neurologische Erkrankungen: Epilepsie, ADHSo psychiatrische Erkrankungen: Depression, Psychosen
  • Was sind genetische Polymorphismen? Wozu führen diese? Worin ist die große interindividuelle Variabilität in der Enzymaktivität der CYP 3A- Familie begründet? o Polymorphismus = Auftreten einer Genvariation in einer Population mit einer Häufigkeitvon >1%o kann zu einem verlangsamten oder ultraschnellen Metabolismus führen, was dazu führt,dass die Medikamente nicht richtig wirken Æ entweder Nebenwirkungen und Toxizitätoder unwirksamo CYP3A: hepatische Expression variiert stark (50-fache Variabilität), bis zu 20-facheunterschiedliche Arzneistoff-Clearance
  • Eine Deletion von T1795 auf CYP2D6*6 führt zu einem Stoppkodon in Exon 3. Wie nennt man eine solche Mutation? Wirkt eine solche Mutation im CYP450 2D6 Gen auf den Metabolismus relevanter Cytochromsubstrate aus, wenn die Mutation nur auf einem Allel vorhanden ist? Warum? o Nonsense-Mutationo nein, wirkt sich nicht aus, weil die Mutation auf beiden Allelen vorhanden sein muss(autosomal rezessive Vererbung) um die Expression von CYP 2D6 zu verhindern
  • 3 Arten von Punktmutationen o Missense Mutation: entstehendes Codon codiert andere Aminosäureo Nonsense Mutation: entstehendes Codon ist ein Stoppcodono Frame-shift Mutation: Deletion oder Insertion (Addition) einer Baseo Silent Mutation: codiert für die gleiche Aminosäure
  • Klinisch relevante Polymorphismen von P450 Familie. o Man unterscheidet 3 klinisch relevante Polymorphismen: P450 2C9, P450 2C19, P4502D6o Bedeutung für die Medikamentenverträglichkeit (klinische Relevanz): 2D6 > 2C19 > 2C9
  • Cytochrom P450 Enzyme o kein einheitliches Enzym, sondern zahlreiche Isoenzymeo besteht aus einem Häm-Protein CYP450 und der CYP450 Reduktaseo Monooxygenaseno ubiquitäre Enzyme -> bei Säugern verstärkt in der Leber exprimierto Zelluläre Lokalisation im ER & an der inneren Mitochondrienmembrano Mensch: 18 CYP- Familien (insgesamt ca. 500 CYP-Gene bekannt)o Familien 1-3 sind an der Biotransformation von AM beteiligto geringe Substratspezifität
  • CYP3A Familie (CYP3A4) o 60% aller eingesetzten AM über diese Familie verstoffwechselto Metabolisierung endogener Steroideo kein genetischer Polymorphismuso hepatische Expression variiert stark (50-fache Variabilität), bis zu 20-fachunterschiedliche AM- Clearance
  • Polymorphismus von CYP 2D6 Enzymen (=Spartein/Debrisoquin) o 25% der AM werden von CYP 2D6 metabolisierto 5-10% der europäischen Bevölkerung exprimiert kein CYP2D6o 10% intermediate Metabolismuso 2-3% ultrarapide Metabolismuso 80% extensive Metabolismuso autosomal rezessive Vererbung
  • CYP2D6- Phänotypen und Konsequenzen o Langsamer Metabolisierer: Gen in beiden Allelen Inaktiviert, AM werden sehr langsammetabolisiert -> Nebenwirkungen, Toxizitäto Intermediärer Metabolisierer: ein Allel mit reduzierter Aktivität, eines durch Mutationfunktionslos -> Nebenwirkungeno Normaler Metabolisierer: normale Enzymaktivität Æ AM wirksamo Ultraschneller Metabolisierer: sehr starke Enzymaktivität auf Grund von Genduplikation-> AM unwirksam
  • CYP2D6- Phänotypen und Konsequenzen o Langsamer Metabolisierer: Gen in beiden Allelen Inaktiviert, AM werden sehr langsammetabolisiert -> Nebenwirkungen, Toxizitäto Intermediärer Metabolisierer: ein Allel mit reduzierter Aktivität, eines durch Mutationfunktionslos -> Nebenwirkungeno Normaler Metabolisierer: normale Enzymaktivität Æ AM wirksamo Ultraschneller Metabolisierer: sehr starke Enzymaktivität auf Grund von Genduplikation-> AM unwirksam
  • Polymorphismus von CYP 2D6 Enzymen (=Spartein/Debrisoquin) o 25% der AM werden von CYP 2D6 metabolisierto 5-10% der europäischen Bevölkerung exprimiert kein CYP2D6o 10% intermediate Metabolismuso 2-3% ultrarapide Metabolismuso 80% extensive Metabolismuso autosomal rezessive Vererbung
  • Grundlage der Genotypisierung o genomische DNA wird auf Mutation untersuchto Ausgangsmaterial: weiße Blutzellen (oder andere kernhaltige Zellen: Haarwurzel…)o Nach der Extraktion der DNA wird ein Vervielfältigungsschritt benötigt, um denjenigenBereich auf der DNA zu vermehren, der den Polymorphismus enthälto PCR: Erzeugung vieler Kopien eines spezifischen DNA- Fragment
  • Signaltransduktion bezeichnet die Weiterleitung einer Information über die Zellmembran hinweg in die Zielzelle.
  • Zelluläre Kommunikation o Gap Junctionso Zell-Zell und Zell-Matrix Interaktioneno Extrazelluläre Signalübertragung EndokrinParakrinAutokrin
  • G-Protein gekoppelte Rezeptoren o Hormone (glandotropeHypophysenhormone (ACTH,LH, FSH, TSH), Glukagon,Parathormon, Histamin, …)o Neurotransmitter (GABABRezeptor, Serotonin)
  • Ligandengesteuerte Ionenkanäle nicotinischer Acetylcholinrezeptor,GABAA- und Glycinrezeptoren,AMPA- und NMDA Rezeptoren
  • Enzymgekoppelte Rezeptoren Transmembranproteine mitintrazellulär-aktivierbarerEnzymaktivität o Guanylatzyklaseno Rezeptortyrosinkinaseno RezeptorSerin/Threoninkinasen
  • Zytokine Zytokine sind Proteine, die fundamentale Prozesse wie Wachstum, Differenzierung und Zellfunktion regulieren. Wirkungo meist parakrin oder autokrino in einigen Fällen auch endokrin (Bsp.:IGF, Erythropoetin)Einteilungo Wachstumsfaktoreno Hämatopoetine (hämatopoetischeWachstumsfaktoren)o Zytokine des Immunsystems umfassen folgende Rezeptortypen:o Rezeptortyrosinkinase TNF- Rezeptoren
  • RANKL Receptor Activator of NF-κB Ligand Bindet an Rank TNF-SuperfamilieRezeptortyp
  • EGF Epidermal Growth Factor EnzymgekoppelterRezeptor
  • MAP mitogen activated protein oMAP Kinasen sind Proteinkinasen aus der Familie der Serin-/Threonin KinasenoAktivierung durch Bindung von Wachstumsfaktoren an ihren spezifischen Rezeptor
  • MAP Kinasen Kontrollieren fundamentale Zellprozesse oWachstumoProliferationoDifferenzierungoMigrationoApoptose
  • Stimuli zur Aktivierung nach Rezeptor-Ligand Interaktion bei Map kinasen o Zytokineo Wachstumsfaktoreno Mitogeneo Stressfaktoren
  • Drei wichtige Gruppen von MAP Kinase Signalkaskaden: o ERK 1/2 (extracellular signal regulated kinase)o JNK (cJun- NH2-terminal kinase)o p38 MAP kinase
  • MAP Kinase Signalweg Ligandenbindung Rezeptordimerisierung Autophosphorylierung Tyrosinphosphorylierung als Ankerplätze Rekrutierung von Signalproteinen durchTyrosinphosphorylierung Rekrutierung von intrazellulären Proteinen überSH2-Domänen Aktivierung desSchalterproteins -Ras (G-Protein) über GEF, GAP macht wieder zurück Ras->Raf->MEK->Erk -> Phosphoryliert Substrat das an DNA bindet
  • GEF guanine nucleotide exchange factor
  • GAP GTPase activating protein
  • Pathologische Bedeutung MAP Kinase Signalweg Bedeutung bei der Krebsentstehung Krebsassoziierte Veränderungen im ERK Signalweg:oÜberexpression von Rezeptor-Tyrosin-Kinaseoaktivierende Mutationen bei Rezeptor-Tyrosin-Kinaseoautokrine oder parakrine Produktion von signalweg-aktivierendenLigandenoRas und Raf Mutationen
  • Therapeutische Ansätze bei überaktiviertem EGF Rezeptor Tyrosinkinase-Inhibitoreno niedermolekulare Verbindungeno oral verabreichtWirkstoffeo Erlotinib (Tarceva®)o Gefitinib (Iressa®) Wirkmechanismuso Hemmung der Signaltransduktion intrazellulär Hemmung der Tyrosinkinase am EGFR Monoklonale Antikörper Wirkstoffeo Cetuximab (Erbitux®)o Panitumumab (Vectibix®)Wirkmechanismuso Blockiert die Bindung des Liganden (EGF)
  • NF-κB NF-κB = nuclear factor kappa B umfasst eine Familie von Transkriptionsfaktoreno erstmals im Zellkern von B-Lymphozyten im Jahre 1986 entdeckto ubiquitär in vielen anderen Zellen aufzufinden
  • NF-κB Signalweg Physiologische Bedeutung Regulation der ImmunantwortenEntzündungsreaktionenApoptosen
  • Pathologische Bedeutung NF-κB Signalweg Irrtümliche Aktivierung von NF-κB istassoziiert mit:o Krebso Autoimmunerkrankungeno neurodegenerativen Erkrankungeno kardiovaskulären Erkrankungeno Diabeteso chronischen Entzündungserkrankungen
  • Aktivierung des NF-κB Signalweges • Zytokine (z.B: inflammatorisch wirksameZytokine der TNF Familie; Interleukine)• Bakterielle/virale Infektionen• Endotoxine (LPS = Lipopolysaccharide)• Körperlicher Stress (UV-Bestrahlung, …)• Oxidativer Stress (ROI – reaktive Sauerstoffspecies)• Karzinogene und Tumor-Promotoren
  • Klassische Aktivierung des NF-κB Signalweges Aktivierung der entsprechenden Rezeptoren an der Zelloberfläche Aktivierung des IκBKinasekomplex (IKK) Übertragung von Phosphatgruppen Ubiquitinierung von IκB  Abbauvon IκB durch Proteasomen NF-κB transloziert in den Zellkern Regulation von Zielgenen
  • Inhibitoren des NF-κB Signalweges Wirkstoff: Cyclosporin AMechanismus: Hemmung derProteasomen und dadurchHemmung des IκB Abbaus Wirkstoff: NSAIDs (Aspirin,Salicylate), FlavonoideMechanismus: Hemmung derSerin/Threonin Proteinkinase IKK Wirkstoff: Glukokortikoide(z.B. Dexamethason)Mechanismus: Steigert dieProteinsynthese von IκBα
  • Detektionssysteme für Western Blot Chemolumineszenz  HRP-konjugierte Antikörpero Fluoreszenz  Fluoreszenz-markierte Antikörpero Colorimetrie  Alkalische Phosphatase-konjugierte Antikörper
  • Methode zur Kristallbildung Hanging drop method
  • Angström und aussehen des Proteins 5.5 generell das Protein 3.5 Hauptkette 1.5 Atoms located within +-0,1A

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