Biotechnologie (Fach) / VL5: Enzyme (Lektion)

VL5

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• Warum braucht man Enzyme? Erkenntnis aus dem Zellstoffwechsel chemische Reaktionen laufen unter den in Lebewesen typischen Bedingungen nur in gegenwart von Katalysatoren hinreichend schnell ab (Stoffkonzentrationen, Druck, pH, Temperatur)
• Was sind Enzyme? Was machen sie? -globuläre Proteine mit katalytischer Aktivität -Wechselwirkung Enzym und umzusetzender Stoff => Steigerung Reaktionsfähigkeit, Beschleunigung, GW wird nicht verändert
• Wie ist der grundsätzliche Ablauf der enzymatischen Reaktion? E + S => ES => ES+ => EP => E + P  die freie Enthalpie wird durch das Enzym herabgesetzt
• Enzymatische Reaktionen: Was wird beeinflusst? Was nicht? Was tritt im Reaktionsprofil auf? -Aktivierungsenergie wird erniedrigt; Aktivierungsenergien Hin- und Rück unterscheiden sich um Betrag freie Aktivierungsenergie => wirkt auf beide gleich? -Enzyme können die Einstellung eines Gleichgewichtes beschleunigen ohne GW-Lage der Reaktion zu verändern -lokale Minima und Maxima: wobei Minima kurzlebige Intermediate, Maxima Übergangszustände
• 3 Merkmale Enzym-Substrat-Interaktion -Substratspezifität -Reaktionspezifität -Regulierbarkeit der Enzymaktivität
• Wie ist Substratspezifität? Wann kann Aussage getroffen werden? Spezifität ggü. Stereoisomere? -unterschiedlich: Lipasen und Proteinasen können zb allgemein Ester- und Peptidbindungen erkennen, Trypsin und Chymotrypsin nur Peptidbindungen zwischen bestimmten AS -wenn das Enzym in reiner Form vorliegt -streng spezifisch für Stereoisomere
• aktives Zentrum Aufbau, Aussehen, Bindung, Beteiligung, Modell -aus AS, Proteinfaltung räumliche Annäherung -Vertiefung im Enzym -höhlen und spaltenförmige Vertiefungen -oft Cofaktoren beteiligt -von Schlüssel-Schloss zu induced fit
• Cofaktoren Def, Arten, Enzym mit oder ohne Cofaktor -kleine Moleküle, die die Enzymaktivität beeinflussen -Metalle und Coenzyme hier fest: prostetisch, lose: Cosubstrat -Apo und Holoenzym
• wichtige Coenzyme Beispiele Thiaminpyrophosphat bei der oxidativen Decarboxylierung Flavinmononucleotid beim Wasserstofftransfer Pyridoxalphosphat Transaminierung, Decarboxylierung
• Enzymklassifikation Nr und Bsp -systematischer Name -EC-Nummer: 4 Ziffern 1. in die 6 Hauptklassen 2 und 3: chemische Einzelheiten 4: Nummerierung
• 6 Enzymklassen mit Beispielen -Oxidoreduktasen => Alkoholdehydrogenase -Lyasen => Citratlyase -Hydrolasen: Galactosidase  -Isomerasen Glucoseisomerase -Transferasen Hexokinase -Ligasen D-Ala-D-Ala-Ligase
• Enzymatische Analyse: 2 unterschiedliche analytische Verfahrensweisen 1) Ermittlung Enzymaktivität: analytische Behandlung kann nachgewiesen werden Bsp Peroxidase und Phosphatase Milch, Amylase Honig 2) analytische Bestimmung Substanzen mithilfe von Enzymen
• Optischer Test nach Otto Warburg Methode zur Bestimmung der enzymatischen Aktivität von NAD- bzw. NADP-abhängigen Dehydrogenasen => Grundlage Lambert-Beersches  Gesetz
• optischer Test Reaktion Bsp Substrat + Coenzym => Produkt + Coenzym - Bsp Lactat + NAD =>Pyruvat + NADH + H+
• Temperaturabhängigkeit Enzymaktivität -Geschwindigkeit erhöht sich innerhalb Temperaturbereich -danach Abfall wegen Denaturierung
• Einfluss pH auf Enzymaktivität pH, Ursachen pH 4-9 Ursache: reversible Dissoziation / Ionisierung
• Ursachen Proteindenaturierung -physikalische Einwirkungen: Hitze, Kälte, mechanische Kräfte, Strahlung -chemische Einwirkung: Säure, Lauge, Lösungsmittel, Oxidationsmittel...
• Anwendungsbereiche Enzyme 4 Bereiche Waschmittel, Nahrungs- und Futtermittel, andere technische  Anwendungen
• Wirtschaftliche Bedeutung -Marktvolumen: 4-5 Mrd Euro  -Markt der Enzyme: Produkte aus Enzymen 200 Mrd Euro
• Anteile Gesamtmarkt Enzyme -Waschmittel 26 % -Tierfutter 22 % -Stärkeabbau 16 % -Mehl und Backwaren 8 -Käsereifung 8
• Einsatz in Detergentien 4 -Proteasen gegen Proteinflecken -Lipasen gegen Fettflecken -Amylasen gegen Stärkeflecken -Cellulasen Grasflecken
• Textilindustrie 5 -Entfernung stärkehaltige Schlichen: Amylasen - Nichtcellulosekomponenten: Pektylase -Bleichmittel: Peroxidasen -Fusseln: Cellulasen -Jeans ausgewaschen: Cellulase
• 4 Arten Enzymeinsatz LM -aktive Enzyme Rohwaren -mikrobielle Enzyme  -Lebensmittelzusatzstoffe, Verarbeitungshilfstoffe -aktive Enzyme ernährungsphysiologisch
• erwünschte und unerwünschte Vorgänge Bedeutung -unerwünscht: Weichwerden, Rohfaseranteil Verminderung, Bräunung, Veratmung Zucker, Süßwerden, Bitterwerden, Bleichung, Geruch -erwünscht: Aromabildung, Gärung alk. Getränke, Oxidation Essigsäure, Fermentation Kaffee / kakao, Teefermentation, Milchsäuregärung, Backware
• Einsatz Enzyme in der Getränkeindustrie 3 Getränke 1) Fruchtsaft: -Pektinasen Schälen, Abbau Polysaccharide;  -Nariginasen, Amylasen, arabinasen bauen diese ab 2) Bier -Amylasen Stärkeabbau -Glucanasen Abbau Glucane -Acetolactatdecarboxylase: Acetatmilchsäure 3) Weinkorken -Laccasen Phenole Polymerisierung
• Enzymen in Babynahrung, Fleisch, Milch 3, Backware, Konservierung 5 -Proteasen: Allergenabbau -Fleisch: Proteasen zarter -Milch: beta-Galactosidasen, Chymosin, Lipasen -Backwaren: Proteasen -Konservierung: Lysozym, beta-Glucanasen, Chitinasen, Glucoseoxidation, Lactoperoxidasen
• Enzyme in Futtermitteln Warum? 3 Fälle Erhöhung Verdaulichkeit -nicht ausreichend vorhandene Enzyme -keine eigenen Enzyme -keine eigene Enzyme und antinutrive Wirkung zb Phytinsäure, Hemicellulase
• Phytasen Einsatz -Phytate wertvolle Phosphorquelle, binden Mineralstoffe -Geflügel und Schweinezucht, Umweltschutz durch Reduktion Phosphatausscheidung
• Herkunft von Enzymen tierisch, pflanzlich, Mikroorgansimen tierisch: Labenzym durch Reinigen, Extraktion, Filtration etc, Einengen, Fällen pflanzlich: Papain, Bromelain, alpha und beta Amylase Gerste Problem: geringe Gehalte, deswegen große Rohstoffmengen -Mikroorganismen:  schnelle Produktion, unabhängig von Umwelt, hohe Ausbeuten, extra und intrazelluläre Enzyme (müssen noch aufgereinigt werden)
• Immobilisierung von Enzymen grundsätzlicher Sinn 5 Vorteile, 3 Nachteile -hohe Kosten => Wiederverwendung -Vorteile: Kontrolle, Stabilisierung, weniger Inhibierung, Vermeidung Kontamination, Einsatz Reaktorsysteme -Nachteile: Verdünnung (Einsatz katalytisch unwirksamer), Aktivitätsverlust, Versuch-Irrtums-Ansätze
• 4 grundsätzliche Strategien der Immobilisierung -reversible, physikalische Immobilisierung -irreversibel an Träger -Einschluss -Vernetzung
• 3 Möglichkeiten des Einschlusses -Mikroeinschluss -Geleinschluss -Einschluss in Hohlfasern
• 4 Methoden Vernetzung von Enzymen mit Abkürzung -quervernetzte Enzyme CLEs -quervernetzte Enzymkristalle CLECs -quervernetzte Enzymaggregate CLEAs -cross linked spray-dried enzymes CLSDs   
• Was unterscheidet quervernetzte Enzymkristalle und Aggregate? -Enzymkristalle: gereinigte Enzyme, hohe Kosten -Aggregate: Fällung aus wässriger Lösung
• Was ist der Grundgedanke bei trägerfreien Enzymkristallen? -hochkonzentrierte Enzymaktivität -hohe Stabilität -geringe Produktionskosten
• CLEs Eigenschaften -Herstellung durch Quervernetzung -geringe Reproduzierbarkeit, Aktivität und mechanische Stabilität
• CLECs Def, Eigenschaften -Vernetzung von Kristallen -höhere Aktivität, besonders bei sehr kleinen -höhere Stabilität -kommerzielle Anwendung
• CLEAs -keine Reinigung und Kristallisation -Aggregation unter Zusatz geeigneter Agentien  -Aggregation mit bifunktionellen Agentien 
• CLSDs cross-linked spray dried enzymes -geringe Aktivität da Inaktivierung -nicht kommerziell
• Warum Bedarf an Enzymen 4 -Nachfrage für spezifische technische Anwendungen -Effizienz lebender Organismus vs. Anforderungen technischer Einsatz -Stoff- oder Anwendungspatente -ökonomische Proteinherstellung
• 4 Strategien Enzymsuche -Screening -Metagenomics -gerichtete Evolution -computergestütztes Proteindesign
• Screening: Grundprinzip, Potential, Kultivierbarkeit Prinzip: Kultivierung von Mikroorganismen aus natürlichen Nischen wie Thermalquellen, Salzwüsten, Schwämmen, Pflanzenteilen Potential: Hauptteil Biodiversität noch nicht kultiviert nur ein geringer Teil MO ist kultivierbar
• Aus welchen 6 Schritten Screening in industriellem Maßstab? 1. Definition Problem 2. empfindliches, spezifisches Assay 3. Primärscreening 4. Sekundärscreening 5. Enzymreinigung 6. Top Liste Kanidaten
• 4 Probleme beim Screening und Folge -einige MO sind nicht kultivierbar -Notwendigkeit geeigneter Methoden -Wildtypen viele, Schwierigkeit Selektion  -problematische Enzymreinigung => nicht bester, sondern der in ausreichender Menge getestete
• Alternative zum Screening Expressionsklonieren Isolierung einzelner expressionsklonierender Gene aus Donator dann in Wirt
• Def Genom und Metagenom Genom: Gesamtheit der genetischen Information eines einzelnen Organismus Metagenom: Gesamtheit der genetischen Information aller Mikroorganismen zu gegebenem Zeitpunkt
• Was ist Metagenomik? eine Hochdurchsatzsequenzierung, Erstellung Sequenzbiblothek
• Beispiele für Quellen eines Metagenoms -Boden/Luft/ Meer -heiße Quellen -Darmmikrobiota / Human / Pansen
• Def gerichtete Evolution -Evolution im Zeitraffer => Simulation einiger Evolutionsmethoden mit molekularbiologischen Methoden 
• Ablauf gerichtete Evolution in 3 Schritten 1. Generierung zufälliger Mutationen 2. Aufbau künstlicher Selektionsdruck: Temp, pH, Substrat, Enantiomerselektivität 3. Hochdurchsatzscreening

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