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Biologie 1 (Fach) / Püschel (Lektion)

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• CREB und Lernen Synapse -> cAMP -> CREB -> Transkription -> Genprodukte-> Verstärkung der Synapse
• Enhancer Enhancer aktivieren Transkription über grosse Distanzen Enhancer binden spezifische Transkriptionsfaktoren Nur TF reichen nicht aus, um den Enhancer zu aktivieren:Komplex aus Co-Aktivatoren und allgemeinen Transkriptionsfaktoren Enhancer bringt sich über der Polymerase in Stellung und bildet mit ihr einen Mediatorkomplex. Promotor: Startpunkt der Transkription:(Initiationspunkt und Richtung)abhängig von OrientierungEnhancer: Stärke der Expressionunabhängig vonPosition und Orientierung
• Transkriptionsmaschinerie Repressoren der Transkription wirken z. B. durch: Rekrutierung von Histon-Deacetylasen (HDAC) Histon-Methyltransferasen (HMT) Acetylierung: Aktivierung der GenexpressionMethylierung: Repression der Genexpression  
• DNA Methylierung MBP: Methyl CpG Binding Protein HMT: Histon Methyl Transferase 1) Nucleosomen entfernen (Hindernis)2) Nucleosomen aufbauen (Schutz vor falscherInitiation, crpytische TATA Boxen)
• Transkriptionsmaschinerie RNA Polymerasen Allgemeine Transkriptionsfaktoren (TFIID, TFIIB, TFIIH etc.) Co-Aktivatoren (CBP) Sequenzspezifische Transkriptionsfaktoren (CREB) Histonacetylasen/Histondeacetylasen Histonmethyltransferasen Chromatin-Remodeling Komplexe
• Genstruktur: Eukaryonten / Prozessierung eukaryotische mRNA enthaltenmodifizierte 5' und 3' Enden5' Ende: Cap3' Ende: Poly(A)-Ende Prozessierung eukaryotischer mRNA1) 5'-Ende: Capping (mG-ppp-)2) 3'-Ende: Endonuclease3) Polyadenylierung des 3'-Endes4) Splicing zur Entfernung der Introns Kurz nach Beginn der Synthese wird das 5'-Ende der mRNA modifiziert: Capping: mG-ppp-mRNA Cap: 7-Methylguanosin über eine 5'-5'-Triphosphat-Brücke Termination3' Ende der mRNA durch Endonuclease gebildet1) 10 - 30 Nucleotide 3' des Polyadenylierungssignals:pre-mRNA von einer Endonuclease geschnitten2) An das 3'-Ende der pre-mRNA 150 - 250 Adenylat-Reste angeheftet:Polyadenylierung
• Spleissreaktion: Zwei-Schritt-Reaktion: koordinierte Lösung und Bildung vonPhosphodiester-Bindungen: 2 Transester-ReaktionenZahl der Ester-Bindungen bleibt gleich-> keine Energiezufuhr (ATP)
• Eukaryotische Ribosomen 60S-Untereinheit                                          =  80S :))40S-Untereinheit   Initiationternärer Komplex aus Intitiator-tRNA Inititationsfaktor eIF2 und der kleinen 40 S Untereinheit Initiation beginnt am 5'-Ende der mRNA und erfolgtin der Regel am ersten AUG  
• Translation in Eukaryoten im Prinzip wie bei Bakterien ABER: Initiationskomplex erkennt Capbewegt sich in 5'->3' Richtung zum ATGalso: keine interne Initiation!   _____________  |___Prokaryoten______|_________ EukaryotenRibosomen____  |______70 S_________|___________ 80 STranskription und |Translation_____ |___gekoppelt ________|_______getrenntInitiation_______ |____ intern_____ _____|_5'-Ende Cap-abhängig
• Translationsort 1) zytosolische Proteine: Zytosol2) Membran- und sezernierte Proteine: rauhes ERSezernierte Proteine und Membranproteine enthaltenein Signalpeptid: 10 - 15 hydrophobe Aminosäuren Signal Recognition Particle = SRPwird durch ein SRP-Rezeptor in der ER-Membran erkannt. Transkript wird durch einen Translokationskanal durch die Membran in das ER Lumen geleitet. Dort entfernt eine Peptidase das Signalpeptid.   Folie:Membranproteine und sekretierte Proteine: Signalpeptid vom Signal Recognition Particle (= SRP) gebunden Peptid durch Membrankanal in das ER geschleust Peptidase entfernt das Signalpeptid  
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• RNA Interferenz Die RNA-Interferenz (kurz RNAi oder auch RNA-Silencing) ist ein natürlicher Mechanismus in den Zellen von Lebewesen mit einem Zellkern (Eukaryoten), welcher der zielgerichteten Abschaltung von Genen dient. Sie ist ein Spezialfall der Gen-Stilllegung. Die RNA-Interferenz beruht auf einer Wechselwirkung kurzer Stücke von Ribonukleinsäure (RNA) mit der Erbinformation-übertragenden mRNA unter Beteiligung mehrerer Enzymkomplexe. Als Folge wird die mRNA in mehrere Bruchstücke gespalten und die zu übertragende Information wird zerstört oder eine Translation in ein Protein verhindert. Die RNA-Interferenz spielt unter Beteiligung der zelleigenen miRNA bei vielen mehrzelligen Lebewesen bei der Regulation der Genexpression eine wichtige Rolle. Die im menschlichen Organismus auf etwa 1000 geschätzten verschiedenen miRNAs kontrollieren die Aktivität von etwa 30% der menschlichen Gene.Hiervon sind unter anderem zahlreiche Funktionen des Immunsystems betroffen. Damit wird der Regulation der Genaktivität durch miRNA eine ähnliche große Bedeutung beigemessen wie der Regulation durch Transkriptionsfaktoren. Regulation der Genexpression:Auch eine zelleigene Variante der siRNA, die sogenannte esiRNA (endogenous siRNA), ist an der Regulation der Genexpression beteiligt. Diese sowohl bei Pflanzen, Pilzen als auch Tieren vorkommende interferierende RNA dient im Gegensatz zur exogenen siRNA nicht der Virusabwehr.
• Polymerase Kettenreaktion (Polymerase chain reaction) Thermostabile DNA-PolymeraseTaq Polymerase: DNA Polymerase von Thermus aquaticusDNA-Primer (20 -30 nt lange chemisch synthetisierte Oligonucleotide)PCR ermöglicht die Amplifikation vonDNA-Sequenzen aus geringsten Mengen DNA 3 Schritte: (1) Schmelzen (Denaturierung) bei ca. 96 °C. (2) Anlagerung (Primerhybridisierung/Annealing) bei ca. 68 °C. (3) Verlängerung (Elongation) bei ca. 72 °C    (P=Polymerase). Exponentielles Anwachsen des Kurzen Produktes (von Primern eingeschlossener Bereich).
• Sequenzierung nach der Sanger-Methode Die Didesoxymethode nach Sanger wird auch Kettenabbruch-Synthese genannt und stellt eine enzymatische Methode dar. Ausgehend von einem kurzen Abschnitt bekannter Sequenz (Primer) wird durch eine DNA-Polymerase einer der beiden komplementären DNA-Stränge verlängert. Zunächst wird die DNA-Doppelhelix durch Erwärmung denaturiert, woraufhin Einzelstränge für das weitere Vorgehen zur Verfügung stehen. In vier sonst gleichen Ansätzen (alle beinhalten die vier Nukleotide) wird je eine der vier Basen zum Teil als Didesoxynukleosidtriphosphat (ddNTP) zugegeben (also je ein Ansatz mit entweder ddATP, ddCTP, ddGTP oder ddTTP). Diese Kettenabbruch-ddNTPs besitzen keine 3'-Hydroxygruppe: Werden sie in den neusynthetisierten Strang eingebaut, ist eine Verlängerung der DNA durch die DNA-Polymerase nicht mehr möglich, da die OH-Gruppe am 3'-C-Atom für die Verknüpfung mit der Phosphatgruppe des nächsten Nukleotids fehlt. In der Folge entstehen DNA-Fragmente unterschiedlicher Länge, die in jedem Ansatz stets mit dem gleichen ddNTP enden (also nur mit A oder C oder G oder T). Entweder der Primer oder die ddNTPs sind radioaktiv markiert. Nach der Sequenzier-Reaktion werden die markierten Abbruchprodukte aus jedem Ansatz mittels Polyacrylamid-Gelelektrophorese der Länge nach aufgetrennt. Durch Vergleich der vier Ansätze kann man die Sequenz nach der Entwicklung des radioaktiven Gels auf einem fotografischen Film ablesen. Die dementsprechend komplementäre Sequenz ist die Sequenz der verwendeten einsträngigen DNA-Matrize. Als Sequenzier-Reaktion kommt heutzutage eine Variation der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) zum Einsatz. Anders als bei der PCR wird nur ein Primer eingesetzt, sodass die DNA nur linear amplifiziert wird. Seit Anfang der neunziger Jahre werden vor allem mit Fluoreszenz-Farbstoffen markierte Didesoxynukleosidtriphosphate eingesetzt. Jedes der vier ddNTPs wird mit einem unterschiedlichen Farbstoff gekoppelt. Diese Modifikation erlaubt es, alle vier ddNTPs in einem Reaktionsgefäß zuzugeben, eine Aufspaltung in getrennte Ansätze und der Umgang mit Radioisotopen entfällt. Die entstehenden Kettenabbruchprodukte werden mittels Kapillarelektrophorese aufgetrennt und mit Hilfe eines Lasers zur Fluoreszenz angeregt. Die ddNTPs am Ende jedes DNA-Fragmentes zeigen dadurch Fluoreszenz unterschiedlicher Farbe und können so von einem Detektor erkannt werden. Das Chromatogramm (die Abfolge der Farbsignale, die am Detektor erscheinen) gibt direkt die Sequenz der Basen des sequenzierten DNA-Stranges wieder.  
• Expression von rekombinantem Insulin in Bakterien mRNA → in cDNA umschreiben mit Reverser Transkriptase → cDNA-Klon → PCR → Klonierung → Sequenzierung → Expression
• RFLP Restriction fragment length polymorphism; bezeichnet Unterschiede von DNA-Sequenzen homologer Chromosomen, welche als verschiedene Restriktionsfragmentmuster (z. B. bei der Gelelektrophorese) sichtbar werden. Die Länge eines Restriktionsfragments wird durch Mutation beeinflusst, bei der eine Erkennungssequenz für ein Restriktionsenzym entsteht oder verloren geht. Beispiel: Eine Sequenz enthält bei Person 1 eine Schnittstelle für ein Restriktionsenzym, in der Sequenz bei Person 2 kommt diese nicht vor. Werden nun diese Sequenzen mit einem Restriktionsenzym geschnitten, entstehen bei Person 1 zwei Fragmente und bei Person 2 ein Fragment. Werden nun die Längen der Sequenzen verglichen, kann ein RFLP festgestellt werden, die Fragmente sind unterschiedlich lang, der Locus ist polymorph. RFLPs dienen u.a. als genetische Marker bei der Genkartierung, da sie umso wahrscheinlicher zusammen vererbt werden, je näher sie zusammen liegen. Sie werden darüber hinaus auch zur Suche nach Quantitative Trait Loci, also Chromosomenabschnitten mit Einfluss auf die Ausprägung eines quantitativen Merkmals, sowie in Southern Blots genutzt.
• Anwendung der PCR: Fingerprinting VNTR: repetitive Sequenzen(variable number of sequence repeats)  

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