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Ernährungsphysiologie der Tiere (Subject) / Proteinstoffwechsel (Lesson)

Kapitel Proteinstoffwechsel aus Skript

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  • 3.1 Bestimmung des Rohproteins (N nach Kjehldahl) Hintergrund Der Rohproteingehalt wird über die Bestimmung Bestimmung des Stickstoffs N in der Probe berechnet Zwei etablierte Methoden für die Bestimmung des N: 1. DUMAS (Verbrennungsprinzip; auch anorg. N) und 2. KJEHLDAHL (keine Erfassung von anorg. N) Für Futtermittel ist die Bestimmung nach Kjehldahl vorgeschrieben, da wenn die Probe einen höheren Gehalt an anorganischen N-Verbindungen (z.B. Nitrat) aufweist, würde bei der Methode nach Dumas der Proteingehalt fälschlicherweise höher ausfallen!
  • 3.1 Bestimmung des Rohproteins (N nach Kjehldahl) - Prinzip 1. Säureaufschluss: Der "N" der organischen Stickstoffverbindungen im Probenmaterial wird nach KJEHLDAHL durch Erhitzen mit konz. Schwefelsäure in Gegenwart reduzierender Substanzen (Katalysatoren) in Ammoniumsulfat überführt. 2. Destillation: Nach Zusatz überschüssiger Lauge wird Ammoniak frei und durch Destillation in einer Schwefelsäurevorlage  (3. Vorlage:)als Ammoniumsulfat gebunden. 4. Rücktitration: Der nicht zur Ammoniakbindung verbrauchte Säureanteil wird titrimetrisch mit Natronlauge bestimmt Differenzbildung: Anteil an Ammoniak, der auf "N" umgerechnet werden kann. Da die meisten "Eiweiße" einen annhähernd konstanten N-Gehalt aufweisen, wird der ermittelte "N" mit einem bestimmten Faktor multipliziert, um als Ergebnis den Gehalt an Rohprotein zu erhalten. Stickstoff aus Lebens- und Futtermitteln entstammt: Eiweiß, Amiden (N-haltige, nicht-eiweißartige Verbindungen), NPN-Verbindungen; Rein-Eiweiß und Amide werden unter dem Begriff Rohprotein zusammengefasst.
  • .3.2 Aminosäuren in Nahrungsmitteln Besimmung des Aminosäuremusters in Nahrungsmitteln mittels AAA Prinzip Die Aminosäuren (AS) werden nach salzsaurer Hydrolyse aus dem Peptid bzw. Protein fregesetzt. Anschließend erfolgt die chromatographische Auftrennung des Hydrolysats auf einem Kationenaustauscher mit anschließender Nachsäulenderivatisierung mit Ninhydrin im Aminosäureanalysator. Anmerkung: Tryptophan, Cystein und Methionin sind instabil und werden bei der direkten Hydrolyse nicht quantitativ erfasst.
  • 3.2 AAA - Analyse (Demo vor Ort) Die Trennung der AS erfolgt am Aminosäurenanalysator durch Elution mit Pufferlösungen unterschiedlichen pH-Werts. Das Eluat wird kontinuierlich mit Ninhydrin-Reagenz versetzt und die Extinktion des blau-violett gefärbten Komplexes photometrisch bei 570nm gemessen.
  • 3.3 Bestimmung von AS und weiterer wichtiger N-haltiger Stoffwechselprodukte im Plasma 3.3.1 Bestimmung von Aminosäuren in Blutplasma mittels AAA Im menschlichen Organismus befinden sich etwa 1g, das heißt nur etwa 1% der freien Aminosäuren im Plasma, der weitaus größere Teil ist im Zytoplasma der Zellen lokalisiert. Die quantitative Aminosäureanalytik spielt in der medizinischen Diagnostik bei Störungen im Aminosäurestoffwechsels, wie z.B. der Phenylkentonurie, der Ahornsirupkrankheit u. a. eine wichtige Rolle. Prinzip: Das Plasma wird mit 10%iger Sulfoalicylsäurelösung versetzt, um hochmolekulare Verbindungen (Peptide, Proteine, Polyribonukleinsäuren) und Lipide zu entfernen. Die Probe wird gemischt und zur vollständigen Ausfällung ins Eisbad gestellt. Nach Zentrifugation wird der Überstand mit Puffer verdünnt, um den Ansatz auf einen pH-Wert von 2,2 zu bringen. Die Probe kann direkt zur Aminosäureanalyse eingesetzt werden.
  • 3.3 Bestimmung von AS und weiterer wichtiger N-haltiger Stoffwechselprodukte im Plasma 3.3.2 Gesamt-Eiweiß im Plasma (Biuret-Methode) Eiweißgehalt im Plasma: Hinweise auf Eiweißversorungen der Störungen des Eiweißstoffwechsels (normal: dynamisches Gleichgewicht) verringerte Biosynthese aufgrund von: vermindertes Aminosäureangebot, Leberparenchymschädigungen, vermehrte Ausscheidung in den Gastrointestinaltrakt oder Nierenschädigungen →Hyperproteinämie Prinzip: Peptidverbindungen von Proteinen reagieren mit Kupfer II - Ionen (in alkalischer Lösung)  rot bis blauvioletter Komplex (die sogenannte Biuret-Reaktion)  Die Reaktion ist typisch für Verbindungen mit mindestens 2 CO-NH-Gruppen (Peptidbindungen) und kann so für den Nachweis von Peptiden und Proteinen genutzt werden. Mit Natrium-Kalium-Tartrat wird die Ausfällung von Kupferhydroxid und mit Kaliumjodid die Autoreduktion des Kupfers verhindert. Die Absorption des entstehenden Farbkomplexes ist proportional zur Proteinkonzentration und wird bei 546nm gemessen. (Farbkomplex auf Seite 26)
  • 3.3 Bestimmung von AS und weiterer wichtiger N-haltiger Stoffwechselprodukte im Plasma 3.3.3 Quantitative Bestimmung von Harnstoff im Plasma (BERTHELOT-Reaktion) Theorie: Harnstoff ist das wichtigste Endprodukt im Aminosäurestoffwechsel, dessen Konzentration im Blutplasma durch die renale Ausscheidung reguliert wird. Physiologisch kann es vorübergehend durch hohe Proteinaufnahme bzw. hohen Proteinkatabolismus infolge minderwertiger Nahrungs- oder Futtereiweiße zu Erhöhungen der Konzentration kommen. Ein dauerhafter Anstieg (Azotämie, Urämie) ist ein Hinweis auf eine gestörte renale Ausscheidung und oft auf Nierenschäden zurückzuführen. Prinzip: Harnstoff wird durch Urease quantitativ in Ammoniumcarbonat überführt, das mit Salicylat und Natriumhypochlorit in Gegenwart von Natriumnitroprussid einen grünen Farbstoff (2.2 Dicarboxylindophenol) bildet. Harnstoff + H2O + 2H+ →(Urease)→ 2NH+4 + CO2
  • 3.4 Bestimmung von Protein und weiterer wichtiger N-haltiger Stoffwechselprodukte im Urin 3.4.1 Eiweiß im Urin Die meisten Proteine sind zu groß, um von der Niere in den Urin gefiltert zu werden. Es dürften also nur kleinere Proteine (Peptide) im Urin vorkommen und auch diese nur in geringer Konzentration, da sie zwar zunächst filtriert, später aber rückgeführt werden. Proteine kommen demzufolge im Urin vor, wenn die Filterfunktion der Niere eingeschränkt ist, die Rückaufnahme gestört oder Konzentration an Proteinen im Blut stark erhöht ist. Ein positiver Protein-Nachweis im Urin ist daher das wichtigste Leitsymptom von Nierenerkrankungen, da eine stärkere Eiweißausscheidung im Urin (Proteinurie) meist pathologisch ist. Während der Schwangerschaft oder nach körperlichen Anstrengungen ist ein Eiweißbefund jedoch ohne Bedeutung. Je nach Schädigungsort sind es unterschiedliche Proteine, die im Urin auftauchen, so dass der Diagnose "Proteine im Urin" eine Differenzierung folgen muss. Die im normalen Urin vorkommenden Eiweißspuren sind mit den üblichen chemischen Nachweismethoden nicht erfassbar.
  • 3.4 Bestimmung von Protein und weiterer wichtiger N-haltiger Stoffwechselprodukte im Urin 3.4.1.1 Qualitativer Nachweis von Eiweiß mit Sulfosalicylsäure Eiweiß wird durch Sulfosalicylsäure denaturiert und fällt als unlösliche Trübung aus. Sulfosalicylsäurekomplex auf Seite 31
  • 3.4 Bestimmung von Protein und weiterer wichtiger N-haltiger Stoffwechselprodukte im Urin 3.4.1.2 Halbquantitativer Nachweis von Eiweiß mit Teststreifen Tetrabromphenolblau gibt in saurer Lösung H+-Ionen an Eiweiße ab und ändert dabei seine Farbe von gelb nach grün-blau. Mit dem Streifentest wird vorwiegend Albumin nachgewiesen, auf Globuline reagiert er weniger charakteristisch, und bestimmte Eiweiße (saure Proteine, Glykoproteine, Bence-Jones-Protein und andere Mikroproteine) weist er nicht nach. Er zeigt schon ab 30mg/l eine schwache Färbung und ist ab 100mg/l deutlich positiv (Referenzbereich für Albumin: bis 20mg/l, für Gesamteiweiß: bis ca. 100mg/l).
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  • 3.4 Bestimmung von Protein und weiterer wichtiger N-haltiger Stoffwechselprodukte im Urin 3.4.2 Nachweiß von Harnstoff im Urin Theorie: Hauptquellen der Harnstoffsynthese sind die oxidative und nicht-oxidative Desaminierung der Aminosäuren. Der Harnstoff ist mengenmäßig beim Menschen die Hauptausscheidungsform von Stickstoff im Urin. Er kann als Indikator für den Proteinkatabolismus des Organismus dienen.
  • 3.4 Bestimmung von Protein und weiterer wichtiger N-haltiger Stoffwechselprodukte im Urin 3.4.2.1 Qualitativer Nachweis von Harnstoff im Urin (enzymatische Spaltung mit Urease) Harnstoff wird durch Urease in Ammoniak überführt. Diese Alkalisierung kann durch Phenolphtalein als pH-Indikator sichtbar gemacht werden. -> wird im alkalischen Bereich pink -> im sauren Bereich rot
  • 3.4 Bestimmung von Protein und weiterer wichtiger N-haltiger Stoffwechselprodukte im Urin 3.4.3 Bestimmung von Harnsäure im Urin (Uricase Methode - TBHBA) Theorie: Harnsäure ist beim Menschen und den Primaten das schwer lösliche N-haltige Endprodukt des Purinstoffwechsels. Die ausgeschiedene Harnsäure entstammt einem exogenen Anteil, der aus dem Puringehalt der Nahrung kommt und einem endogenen Anteil aus dem Abbau der Nucleinstoffe im Organismus. Dieser beträgt bei völlig purinfreier Ernährung 0,5g/Tag. Die Salze der Harnsäure werden als Urate bezeichnet (Nierensteine). Ein erhöhter Gehalt an Harnsäure im Serum ist ein wichtiger Hinweis auf die vorwiegend erblich bedingte Stoffwechselstörung Gicht (primäre Hperuricämie). Hier kommt es zur Ablagerung von Uratkristallen vor allem in den Gelenken, und die renale Harnsäureausscheidung ist i.d.R. vermindert (unter 300 mg Harnsäureäquivalente pro Tag). Nutritive Gegensteuerung erfolgt durch eine purinarme Kost. Bei den anderen Säugern wrid die Harnsäure durch Uricase zu Allantoin abgebaut, welches leichter löslich ist und renal ausgeschieden wird. Prinzip: Harnsäure wird durch Uricase zu Allantoin oxidiert. Hierbei entstehendes Wasserstoffperoxid reagiert mit 4-Aminoantipyrin und 2,4,6-Tribromo-3-Hydroxybenzoesäure (TBHBA) unter katalytischer Wirkung der Peroxidase (POD) zu einem rotgefärbten Chinoniminfarbstoff, der photometrisch bei 520nm gemessen werden kann.
  • 3.4 Bestimmung von Protein und weiterer wichtiger N-haltiger Stoffwechselprodukte im Urin 3.4.4 Bestimmung von Kreatinin im Urin Theorie: Kreatinin stammt zum größten Teil aus der Muskeltätigkeit, aber auch aus der Fleischnahrung und bei Hunger aus der Einschmelzung von Muskelmasse. Die Gesamtausscheidung scheint der Muskelmasse proportional zu sein. Die Kreatininclearance kann auch zur Prüfung der Nierenfunktion verwendet werden. Prinzip: Kreatinin bildet mit Pikrinsäure im Alkalischen einen orangeroten Farbstoff, der photometrisch bei 520nm gemessen werden kann. Reaktionsschema Seite 38
  • 3.5 Die Ermittlung der Biologischen Eiweißwertigkeit Biologishe Eiweißwertigkeit: Der Anteil des absorbierten Nahrungsproteins, der im Körper zur Deckung des Bedarfs für definierte physiologische Funktionen retiniert wird. Die Qualität der Nahrungsproteine ist abhängig von ihrer Aminosäure-Zusammensetzung unter Berücksichtigung der Verdaulichkeit und der Verfügbarkeit der AS im Stoffwechsel. Sie lässt sich am besten durch Vergleich mit einem Referenzprotein bzw. einem "idealen AS-Muster" bewerten. Die Ermittlung der biologischen Eiweißwertigkeit (BW) kann über chemisch analytische Verfahren In-vivo-Verfahren erfolgen.
  • 3.5 Die Ermittlung der Biologischen Eiweißwertigkeit 3.5.1 Chemisch analytisches Verfahren zur Bestimmung der BW mittels EAS-Index von OSER Zur Bestimmung des EAS-Index werden die Gehalte der essentiellen Aminosäuren (EAS) von Proteinen, über deren Wertigkeit eine Aussage getroffen werden soll, analysiert. Mit Hilfe des EAS-Index wird dann der geometrische Mittelwert aus dem Verhältnis der 9 essentiellen Aminosäuren des Testproteins im Vergleich zu einem Referenzprotein (Vollei-Protein; FAO-ideales Protein ⌊nur 8 essentielle Aminosäuren berücksichtigt⌋) gebildet. Als Referenz kann auch das Bedarfsmuster an EAS für eine definierte Altersgruppe (z.B. Kinder im Alter von 2 bis 5 Jahren) dienlich sein. Nachteile EAS: geometrisches Mittel Austauschbarkeit der Aminosäuren keine Verdaulichkeiten berücksichtigt
  • 3.5 Die Ermittlung der Biologischen Eiweißwertigkeit 3.5.1.1 In-vivo-Verfahren zur Bestimmung der BW --- N-Bilanz-Verfahren zur Bestimmung der BW Biologische Verfahren basieren auf einer Bilanzierung des Proteins bzw. des darin mit rund 16% enthaltenen N (N-Bilanzverfahren).
  • 3.5 Die Ermittlung der Biologischen Eiweißwertigkeit 3.5.1.2 N-Bilanzminimum nach Kofranyi und Jekat zur Bestimmung der BW N-Bilanzminimum (nach Kofranyi 1957) = B = A- (F+U) B: Scheinbare N-Bilanz; A= N-Aufnahme; F= Faeces-N; U= Urin-N Nach Kofranyi wird das N-Bilanzminimum von Nahrungsproteinen im Vergleich zum N-Bilanzminimum von Eiprotein als einzige Eiweißquelle (0,5g Rohprotein/ kg KM und Tag) für einen Erwachsenen berechnet. Eine BW über 100% bei Kombination verschiedener Proteinquellen ist bei diesem Verfahren möglich.
  • Von welchen Faktoren hängt die Höhe des Harnstoffspiegels ab? Proteinzufuhr Proteinkatabolismus glomeruläre Nierenfunktion

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