LF12 - Diagnostik (Subject) / ELISA (Lesson)

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• Was ist ein ELISA? Welche Nachweissysteme und Nachweisreaktionen gibt es? Welche ELISA-Typen werden verwendet? ELISA = Enzym linked Immunosorbent Assay-> Verfahren, um z.B. Proteine spezifisch über Antigen-Antikörper-Reaktion nachzuweisenNachweissysteme:- Enzyme -> alkalische Phosphatase (bildet aus p-Nitophenylphosphat Nitrophenol), PeroxidaseNachweisreaktionen: Farbumschlag, Lumineszenz, Fluoreszenz, RadioaktivitätTypen: direkter, indirekter, kompetitiver und Sanwich-ELISA
• Wie funktioniert ein Sandwich-ELISA? - Fängerantikörper ist an Platte immobilisiert -> hat spezifische Bindungsstellen für ein Antigen -> "captur antibody"- Probe mit verschiedenen Antigenen mit unterschiedlichen Epitopen wird auf die Platte gegeben- zu detektierendes Antigen kann spezifische Bindung mit Antikörper eingehen -> Antigen-Antikörper-Komplex- überschüssige Proteine weg gewaschen- Zugabe Detektionsantikörper -> hat spezifische Bindungsstelle für gesuchtes Antigen und besitzt gekoppeltes Enzym, welches die Detektion ermöglicht -> muss monoklonal sein- Bei Zugabe einer Vorstufe eines Farbstoffs kommt es zu einer Farbreaktion durch Umsetzung am gekoppelten Enzym des Detektionsantikörpers- Farbreaktion kann photometrisch gemessen werden -> Signal ist proportional zur Menge des gebundenen Antigens -> Vergleich mit Standardkurve
• Welche Kriterien müssen für einen Sandwich-ELISA erfüllt sein? - Antigene benötigen Mindestgröße -> Bindung am Antikörper an verschiedenen Epitopen- es werden große Mengen Antikörper benötigt- zwischen einzelnen Schritten erfolgen Waschschritte
• Wie verläuft ein indirekter nicht-kompetitiver ELISA? - Antigen mit spezifischer Bindungsstelle für den zu detektierenden Antikörper ist auf Platte fixiert- Zugabe der Probe mit Antikörpern- sind Antikörper mit einer Bindungsstelle für das fixierte Antigen vorhanden, können diese spezifisch an daran binden -> Antigen-Antikörper-Komplex- Rest wird weg gewaschen- Zugabe des Detektionsantikörpers -> hat spezifische Bindungsstelle für Antikörper die spezifisch an das fixierte Antigen gebunden sind- Detektionsantikörper haben gekoppeltes Enzym, um Farbreaktion durch Zugabe einer Farbstoff-Vorstufe auszulösen- Detektionsantikörper muss nicht in allen Fällen monoklonal sein- Signal ist proportional zur Antikörper-menge
• Wie verläuft ein kompetitiver ELISA? - Antigene mit Bindungsstellen für zu detektierenden Antikörper an Platte fixiert- Ziel-AK aus der Probe hat Bindungsstelle für fixiertes Antigen- Detektionsantikörper hat ebenfalls Bindungsstelle für fixiertes Antigen und gekoppeltes Enzym- Antikörper aus der Probe und Detektionsantikörper binden an Antigen -> Antigen-Antikörper-Komplex- ist viel Ziel-AK in der Probe enthalten binden mehr Ziel-AK an das Antigen als Detektionsantikörper -> nur wenig Farbstoff umgesetzt - ist wenig Ziel-Ak in der Probe enthalten, binden mehr Detektionsantikörper als Ziel-AK an die Antigene -> viel Farbstoff umgesetztResulrierende Signalstärke ist umgekehrt proportional zur Menge an Antikörper in der Probe(Konzentration des Detektionsantikörpers bekannt)
• Welche andere Form des kompetitiven ELISAs gibt es? - Bindung AK an Mikrotiterplatte- Markiertes Antigen und Antigen aus Probe dazu gegeben-> bei sehr kleinen Antigenen

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