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Lernfeld 6 - molekularbiologisches Arbeiten und Biochemie (Subject) / Proteinbestimmung (Lesson)
Proteinbestimmung durch Färbeassays und Photometrie
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- DNA absorbiert bei 260 nm. Wie lässt sich die Menge an DNA in der Probe berechnen? dsDNA: E=1 -> 50µg/ml dsDNAssDNA: E=1 -> 33µg/ml ssDNAssRNA: E=1 -> 40µg/ml ssRNAüber den Dreisatz kann so die Menge an DNA/RNA in der Probe berechnet werden
- Wie kann die Reinheit der DNA/RNA photometrisch bestimmt werden? für DNA: E260/E280 = 1,8 bis 2,0für RNA: E260/E280 = 1,9 bis 2,1
- Nenne und beschreibe 5 Färbeassays zur Proteinbestimmung. Ninhydrin-Assay:- weist freie Aminogruppen nach -> Protein muss in Amiosäuren hydrolysiert werden- bei Reaktion mit Ninhydrin entsteht ein Farbstoff, der Absorptionsmaximum bei 570 nm hatBiuret-Assay:- CO-NH-Guppe reagiert mit Kupfersulfat in alkalischem Milieu -> rotvioletter FarbstoffPierce-Assay:- Kombination Biuret mi Bicincholinsäure- Cu2+ zu Cu+ refuziert -> bilet mit zwei Bicincholin-Molekülen einen violetten FarbkomplexLowry-Assay:- Kombination Biuret mit Folin-Chiocalteau-Reagenz- Preotein-Kipferkomplex unterstützt Reduktion von Folin-Chiocalteau-Reagenz durch Tyrosin und Tryptophan -> tief blauer FarbkomplexBradford-Assay:- verschiebung des Absorptionsmaximums von Coomassie-Brillantblau von 465 nm nach 595 nm -> blauer Farbstoff gebildet
- Wie kann die Proteinkonzentration photometrisch bestimmt werden? Messung bei 280 nm:- aromatische Aminosäuren absorbieren- Problem: Nucleinsäuren absorbieen bei 280 nm - bei nucleinsäurehaltigen Proben zusätzliche Messung bei 260 nmProteinkonz. = 1,55 * A280 - 0,76 * A260Messung bei 205 nm:- Peptidbindungen absorbieren- Problem: sämtliche Verbindungen mit C=C und C=O absorbieren
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