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Lernfeld 6 - molekularbiologisches Arbeiten und Biochemie (Subject) / Biotechnologische Methoden (Lesson)
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- Was versteht man unter der Begriff der Klonierung? gezielte Vervielfältigung von DNA-Molekülen in einem Wirtsoranismus
- Was versteht man unter dem Begriff Klonen? Entstehung identischer Organismen und nicht nur einzelner Moleküle
- Was ist ein Vektor? Was für Vektoren gibt es? Genfähre -> DNA-System, in das aus einem anderen Genom ausgeschnittene Fragmente eingeführt und vermehrt werden könnenPlasmid, Phagen, Cosmide, BACs, YACs, retrovirale Vektoren
- Was sind Restriktionsenzme? DNA-modifizierte Enzyme, die punktsymmetrisch ds-DNA-Sequenzen erkennen und schneiden (durch splatung der Phsphodieesterbindung); die Erkennungssequenzen sind palindromisch
- Was versteht man unter eine Ligation? Das Zusammenfügen doppelsträngiger DNA-Fragemente durch Knüpfung von Phophodiesterbindungen durch das Enzym Ligase
- Was ist eine Dephosphorylierung und für was wird sie verwendet? Entfernung der 5´-Phosphate an den Enden einer Restriktionsschnittstelle durch Enzyme, z.B. alkalische Phosphatase.Verhindert die selbstständige Religation der Schnittstellen
- Was versteht man unter dem Begriff Transformation? - Übertragung eines Vektormoleküls in eine Bakterienzelle, auch bei Pflanzen und Hefen möglich;- Entstehung einer Krebszelle in einem tierischen Organsmus
- Was versteht man unter einer Transfektion? Übertragung eines Vektomoleküls in eine Säugerzelle bzw. eine tierische Zellkultur-Zelle
- Wie wird die Aktivität von Restriktionsenzymen und wie die Aktivität von Ligasen angegeben? - Restriktionsenzyme: Unit -> 1U verdaut 1 µg λ-DNA in 1h vollständig- Ligasen: Weissunits -> 0,01 Weissunit Ligase fügt innerhalb von 20 Min mehr als 95% der Fragmente zusammen
- Wo stammen Restriktionsenzyme her? werden aus Bakterien isoliert; sie nutzen diese um Fremd-DNA zu zerstören;sie unterscheiden Framd-DNA von eigener DNA, indem sie ihre eigene DNA methylieren
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- Was sind Isoschizomere? Restriktionsenzyme aus unterschiedlichen Organismen, die jeweils die gleichen Sequenzen gleich schneiden; haben oft unterschiedliche Pufferbedingungen
- Was für Schnittstellen können durch den Einsatz von Restriktionsenzymen entstehen? - blunt ends (glatte Enden)- sticky ends mit 5´oder 3´Überhang
- Aus welchen Bestandteilen besteht ein Ansatz für ein Restriktionsverdau und welches Volumen wird verwendet? Ein Ansatz sindmeist 20 µl- Wasser- definierte Menge an DNA (0,2-2µg)- passender Puffer für das Enzym (1x konezntriert)- Restiktionsenzym (1U für 1µg DNA)
- Was muss bei der Durchführung eines Restriktionsverdaus beachtet werden? - Verwendung keleiner Volumina, da so ie Wahrscheinlichkeit steigt, dass die Schnittstellen auf der DNA durch das Restriktionsenzym gefunden werden- ENzyme dürfen nicht mehr als 5-10% des Gesamtansatzes ausmachen, da sonst das Glycerin in dem sie gelagert sind die Enzymaktivität beeinträchtigt- Zugabe des Enzyms erst ganz zum Schluss, dami es nicht unter falschen Bedingungen inkuiert wird
- Was muss bei der Durchführung eines Restriktionsverdaus beachtet werden? - Verwendung keleiner Volumina, da so ie Wahrscheinlichkeit steigt, dass die Schnittstellen auf der DNA durch das Restriktionsenzym gefunden werden- ENzyme dürfen nicht mehr als 5-10% des Gesamtansatzes ausmachen, da sonst das Glycerin in dem sie gelagert sind die Enzymaktivität beeinträchtigt- Zugabe des Enzyms erst ganz zum Schluss, dami es nicht unter falschen Bedingungen inkuiert wird
- Wie ist der grobe Ablauf einer Klonierung? - Isolierung eines Vektors und isolerung der gewünschten DNA, die in den Vektor eingebracht werden soll- beide DNAs werden jetzt mit den gleichen Restriktionsenzymen geschnitten, um gleiche Schnittstellen zu erhalten- Aufreinigung nach dem Restriktionsverdau, um kleine DNA-Fragmente, die durch das Schneiden entstanden sind zu entfernen- Zusammenbringen des geschnittenen Vektors und der geschnittenen Fremd-DNA- Ligation- einbringen des modifizierten Vektors in ein Bakterien = Transformation- ausplattieren der Bakterien und Selektion um Bakterien zu identifizieren, die den richtigen Vektor eingebaut haben
- Was sind DNA-Banken und wie werden sie hergestellt? DNA-Baken enthalten die gesamte Erbinformation eines Organismus. Sie besteht aus Bakterien, die einzelne Fragmente der DNA eines Organismus aufgenommen haben. Herstellung: DNA mit Hilfe von Restriktionsenzymen gespalten und die Bruchstücke in Vektoren (z.B. Plasmide) kloniert. Ist die Transformation erfolgreich, werden alle Fragmente der DNA von den Bakterien aufgenommen.
- Was ist eine cDNA und wie wird sie hergestellt? - aus einem Organismus wird die mRNA isoliert- Zugabe von Reverse Transkriptase und Nukleotiden -> bildet einen komplementären DNA-Strang an die mRNA- Zugabe von RNase -> baut die mRNA ab- Zugabe einer DNA-Polymerase und Nukleotiden -> bildet einen komplementären Strang zum vorher gebildeten DNA-Strang --> cDNAcDNA ist also DNA, die aus einer mRNA gebildet wird
- Wie geht die Sanger-Sequenzierung von statten? - es werden 4 Ansätze angefertigt- in jeden Anatz werden zu einem DNA-Matrizenstrang DNA-Nuleotide und je eine Sorte dd-Nulkeotide (= Di-Desoxynukleotide) gegeben -> ddNukleotide haben a C3-Atom keine OH-Gruppe und können so kein weiteres Nukleotid binden -> es kommt zum Abbruch der Stran-Synthese- die Ansätze werden inkubiert und anschließend mittels Gelelektrophorese aufgetrennt- dadurch, dass in den Ansätzen immer nur eine Sorte ddNukleotide enthalten isnd, weiß man genau, welches Nukleotid sich am Ende des Fagments befindet- so kann aus dem Muster eine DNA-Sequenz abgelesen werden- da es sich hierbei dann aber um den Komplemntärstrang zum Matrizen-Strang handelt, muss dieser noch umgeschrieben werden, um die Sequenz des Matrizenstarngs zu erhalten
- Was versteht man unter Blotting? Nenne drei Blotting-Systeme. Blotting = Übertragung elektrophoretisch aufgetrennte Makromoleküle auf spezielle Membranen- southern Blot: für DNA- northern Blot: für RNA- western Blot: für Proteine
- Wie geht der southern Blot von statten? - Restriktionsverdau der DNA -> es entstehen DNA-Fragmente- Auftrennung der Fragmente durch eine Gelelektrophorese- Überführung des Gels in einen alkalischen Puffer -> Denaturierung der DNA- Auflegen einer Membran auf das Gel , darunter hoch konzenriereter Salzpuffer- der Puffer wird durch Kapillarkräfte durch das Gel gesaugt- die DNA-Fragente wandern mit und werden auf die Membran übertragen- Fixierung der Membran
- Warum wird bei der DNA-Sequenzierung nur ein Primer verwendet? - es soll nur ein Strang synthetisiert weren, um die Sequenz ableiten zu können- mit zwei Primern würden zwe verschiedene Enden entstehen und man würde immernoch nicht wissen, welche Sequenz auf der Matrize enthalten ist