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Lernfeld 6 - molekularbiologisches Arbeiten und Biochemie (Subject) / Die DNA (Lesson)
- Welche DNA-Basen gibt es und welche Basen paaren sich miteinander? Adentin, Thymin, Guanin und Cytosin Adenin mit Thymin (2 H-Brücken)Guanin mit Cytosin (3 H-Brücken)
- Was ist der Unterschied zwischen einem Nucleotid und einem Nucleosid? Nucleotid = Base + Zucker + Phosphatrest Nucleosid = Base + Zucker
- Wie ist die DNA aufgebaut? - 2 Einzelstränge durch H-Brücken komplementär und antiparallel zusammengehalten- Stränge in Doppelhelix umeinander gewunden
- Warum ist die DNA als Erbgut geeignet? stabile Formlange Haltbarkeiteinfach zu reproduziereneindeutiger Codespezifisches gibt viele Kombinationsmöglichkeiten
- Für was werden bei der DNA-Isolierung folgende Dinge benötigt: Mörser, Tris/Cl-Puffer, NaCl, SDS, EDTA, Hitze, Kälte, Alkohol, RNase, TE-Puffer, Glucose, NaOH, Kaliumacetat? - Mörser: mechanisches Aufbrechen der Zellwände- Tris/Cl-Puffer: Pufferung- NaCl: hohe Salzkozentration- SDS: Detergens, löste Biomembran auf und denaturiert Proteine- EDTA: komplexiert Ca2+ und Mg2+, hemmt dadruch DNasen- Hitze: Denaturierung und Stärkung der SDS-Wirkung- Kälte: SDS und Zelltrümmer fallen aus- Alkohol: entzieht DNA die Hydrathülle -> DNA fällt aus- RNase: baut RNA ab- TE-Puffer: enthält Tris/Cl und EDTA (s.o.)- Glucose: Nährstoff- NaOH: alkalische Lyse -> löst Zellwand auf, denaturiert DNA- Kaliumactetat: Neutalisation der alkalischen Lyse -> Zelltrümmer, SDS und genomische DNA fallen aus, Plasmide renaturieren
- Wie funktioniert die Plasmidisolierung mit dem Qiagen-Kit? - Herstellung einer Starter-Kultur- Ernten der Bakterien durch Zentrifugation- Aufnehmen der Bakterien in Puffer (mit Tris/Cl, EDTA und RNase)- Zugabe eines zweiten Puffers (mit NaOH und SDS) -> alkalische Lyse -> Suspension wird viskös- Zugabe eines driten Puffers (mit Kaliumacetat) -> Nutralisation -> genomische DNA, Proteine und Zellbestandteile fallen aus- Zentrifugieren- Überstand über Säulchen geben -> DNA bindet an Säule- DNA waschen und anschießend eluieren- DNA-Fällung mit Isopropanol- Zentrifugation- Waschen den Pellets mit Ethanol - Aufnehmen des DNA-Pellets in TE-Puffer oder DNase freies Wasser
- Wie kann man RNA aus Gewebe isolieren? - Gewebe in flüssigem Stickstoff zerkleinern- Zellpulver in GTC-Puffer aufnehmen (mit Guanidinisothiocyanat, N-Laurylsarcosin, Natriumacetat und β-Mercptoethanol)- Zugabe organischer Lösemittel: Natriumacetat, Phenol und Chloroform- Inkubation auf Eis- Zentrifugation -> 3 Phase: oben wässrige Phase mir RNA, Inerphase mit Proteinen, Fetergens, Membranen und DNA, unten Chlorophorm und Phenol- RNA-Lösung abnehmen und mit gleichem Volumen Isopropanol versetzen -> RNA-Fällung- Zentrifugation- RNA-Pellet mit Ethanol waschen und anshcließend trocknen lassen- Pellet in RNase freiem Wasser aufnemen
- Wie isoliert man mRNA aus einer RNA-Lösung die aus Gewebe gewonnen wurde? - RNA-Lösung wird über eine Oligo-dt-Säule gegeben- durch die Poly-A-Schwänze der mRNA bindet sich diese an die Oligo-dt-Nucleotide -> der Rest der RNA geht durch die Säule- Elution der mRNA von der Säule
- Wie kann der Abbau der RNA durch RNasen nach RNA-Isolation verhindert werden? - Kontminationen mit RNasen vermeiden- Inaktivierung der RNasen durch DEPEC- Einfrieren der Probe bei -70°C zur Lagerung- Tragen von persönlicher Schutzausrüstung
- Welche Möglichkeiten gibt es Zellen aufzuschließen? - mechanisch- Frieren/Tauen (bei tierischen Zellen)- French Press- Enzyme- Ultraschall- alkalische Lyse
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