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Genetik (Subject) / Bio- und Gentechnologie (Lesson)
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- Why to Construct Genomic Libraries 1 -to clone and analyze an entire gene with in a single recombinant2 -to clone and analyze a region of eukaryotic DNAencompassing a family of genes3 –to construct physical maps and analyse(e.g. sequence) largeDNA fragments
- Was ist "Cloning"? CLONING is the process of asexually producing a group of cells(clones), all genetically identical, from a single ancestor
- CLONING VECTORS Plasmid(pUC, pBluscript, etc, bacterialorigin) (upto10 kb)Lambda(viral origin) (15-20 kb)Cosmid(viral + bacterialorigin) (35-45 kb)P1 clones(bacteriophageP1 based) (70-90 kb)PAC(P1 combinedwithF factor) (100-300 kb)YAC (YeastArtificialChromosome) (100-500 kb)BAC(BacterialArtificialChromosome) (100-300 kb)
- How to screen a BAC library colony hybridization;-macroarrays or high density filters;-PCR screening using pooled DNA,
- What are physical maps of the genome? 1)Physical maps are maps of physically isolated pieces of the genome–maps of cloned genomic DNA.2) a complete map of each chromosome consist of a series of continuousoverlapping cloned genomic DNA segmentsex tending from one telomereof the chromosome to the other.3) these continuous overlapping clone sets that represent each chromosomemight be considered as giant chromosome walks.4) a complete physical map of a genome consists of a series of maps for eachchromosome set .
- Def: Gentechnologie Technische Nutzung von Methoden zurAnalyse,Isolierung und Veränderung(Neukombination) des Erbgutes.
- Nukleinsäuren: Reinigungsverfahren und Analysemethoden 1. Reinigung von Nukleinsäuren2. Gelelektrophoretische Analyse von Nukleinsäuren3. Markierung von Nukleinsäuren4. Blot-Verfahren5. Sequenzierung von DNA
- 1. Reinigung von Nukleinsäuren zu reinigender Nukleinsäuretyp: dsDNA, ssDNA, Gesamt-RNA, mRNA Primäre Charakteristika: Molekulargewicht (groß - klein)Topologie (linear - zirkulär) Ausgangsmaterial: Organ, Gewebe, Zellkultur Allgemeine Charakteristika zeitlicher Aufwand des Verfahrens, hohedes Reinigungsverfahrens: Ausbeute der Nukleinsäure, Reinheitsgradder Nukleinsäure Verwendungszweck: Blotverfahren, Klonierung, Markierung, cDNAHerstellung,Polymerasekettenreaktion
- Extraktion von Nukleinsäuren aus biologischen Materialien I.) Zelllyse(z.B. osmotischer Schock,Detergentien, Proteasen) II.) Inaktivierung zellulärer Proteasen und Nukleasen(z.B. chaotrope Agentien; Harnstoff, Guanidiniumhydrochlorid) III.) Abtrennung von Nukleinsäuren von anderen molekularen Komponenten(z.B. Phenol/Chloroform-Extraktion)
- Extraktion von Nukleinsäure: Phenol-Chloroform-Extraktion I) Lyse des Ausgangsmaterials (Gewebe, Zellen) II) Extraktion mit Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (24:24:1)Zentrifugation, Isolation der wässrigen Oberphase III) Fällen der Nukleinsäuren mit Alkohol
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- Extraktion von Nukleinsäuren: Plasmidisolation 1. Lyse der Bakterienzellen mit Detergentien(SDS) und NaOH (alkalische Lyse)Chromosomale und Plasmid-DNAdenaturieren in Einzelstränge 2. Neutralisierung des Lysats mitKaliumacetat/EssigsäureRenaturierung der Plasmid-DNA 3. Zentrifugation Sedimentation der chromosomalen DNA;Plasmid-DNA verbleibt in Lösung 4. Ethanolfällung Plasmid-DNA aus Überstand.
- Extraktion von Nukleinsäuren: Isolation von mRNA aus Eukaryoten 1. Auftrag RNA-haltiger Lösung auf Säulemit immobilisierter thymidinhaltiger DNA (oligo(dT)unter Hochsalzbedingungen (500 mM NaCl) 2. Hybridiserung der mRNA über poly(A) an Oligo(dT) 3. Auswaschen nicht-gebundener rRNA und tRNA 4. Elution der gebundenen mRNA durchErniedrigung der Salzkonzentration (Wasser)
- Gelelektrophoretische Analyse von Nukleinsäuren Größenbestimmung / Prinzip Wanderung von Nukleinsäuremolekülenin einem elektrischen Feld durch eineMatrix definierter Porengröße