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Ernährungstoxikologie (Subject) / Einheit 4 (Lesson)
- Kennen Sie Tierschutzaspekte bei Toxikologischen Untersuchungen? 3R-Konzept Replacement: Maßnahmen, die zum Ersatz von Tierversuchen durch Versuche an Zellkulturen oder Computersimulationen führen Reduction: Minimierung der Anzahl an Versuchstieren durch statistische Optimierung und kluges Versuchsdesign Refinement: Versuchsansätze um das Leiden der Versuchstieren zu vermindern Festgelegt durch Tierschutzrichtlinie 2010/63 sowie auf europäischer Ebene
- Beschreibe Muta Maus Sinn Vor-und Nachteile transgenes Nagermodell zur Mutagenitätsprüfung in vivo ein Reportergen (lacZ, codiert für β-Galactosidase) wird auf Mutationen untersucht Dabei wird das lacZ-Gen aus der Maus isoliert, in γ Phagen-DNA eingebaut (in vitro packaging) und anschließend mittels Infektion auf E. coli (lacZ-/galE-) übertragen Die Bakterien werden zum einen zu 0,1 % auf ein Kulturmedium ausgestrichen, um das Kolonienwachstum zu bestimmen. Zum anderen werden sie zu 99,9 % auf ein Selektionsmedium für p-Gal, einem Zweifachzucker, ausgestrichen, um nur das Wachstum der Mutanten für die Mutationsfrequenz zu bestimmen [Mutanten = lacZ- wachsen, da sie aus dem Selektionsmedium keine Galaktose abspalten. BeilacZ+ -Stämmen kommt es zum Absterben, da die UDP-Galaktose-Epimerase in den Bakterien fehlt und aus der UDP-Gal keine UDP-Glucose abspalten kann]. Vorteile: kleinere Tierzahlen (reduction, refinement & replacement!) in vivo Mutagenitäts-Test in unterschiedlichen Geweben (Genmutation als Endpunkt wird untersucht) Methode der Wahl zur Verifizierung von in vitro-mutagenen Effekten Nachteile: arbeitsaufwendig (teuer) für nicht-genotoxische Kanzerogene unsinnig Relativ insensitiv wegen hoher Spontanfrequenz (aber: Steigerung der Sensitivität durch wiederholte Behandlung möglich --> Mutanten-Akkumulation im Gewebe) γ-Systeme: insensitiv gegenüber Klastogenen (verursachen Chromosomenmutation)
- Aufbau des Erythrocyte/bone marrow Micronucleus test Nachweis von strukturellen und numerischen Chromosomenmutationen durch eine Testsubstanz im Knochenmark von Versuchstieren Prinzip aus Mn Test bekannt! Wenn sich Erythroblasten im Knochenmark zu polychromatischen Erythrozyten entwickeln, wird der Zellkern ausgestoßen. Falls Mikronuklei vorhanden sind, verbleiben sie im Zytoplasma und können leicht identifiziert werden wichtige Vorgaben: Versuchstiere: 5 Tiere pro Dosisgruppe und Geschlecht muss bekannt sein, ob das Knochenmark tatsächlich exponiert war genau definierte Parameter und Endpunkte
- Beschreibe UDS Test =unsheduled DNA Test Indikatortest zur Detektion von induzierter DNA-Reparatur in Leberzellen von substanzexponierten Versuchstieren Zeigt an, dass Testsubstanz DNA-Schäden induziert, die durch Exzisionsreparatur beseitigt worden Leberperfusion, Hepatocyten werden radioaktiv markiert (Tritium-Thymidin), DNA Schaden wird mit markierten Basen repariert --> Audioradiographie
- wichtiges zu in vivo Mutations-Assays In vivo Comet, UDS und Micronucleus-Test messen keine Mutationen In vivo Mutationsassays wurden in der Vergangenheit eher selten genutzt Aber: eignen sich für Folgestudien nach positiven Ames-Test Bsp. für transgene Nager-Mutationstests: “Big Blue® Assay”, Muta-Mouse-AssayBeachtung des 3R-Konzepts (Reduce, Refine, Replace)
- Unterschied Indikatortest in Gentoxizitätstests und Mutagenitätstests Indikatortest: Endpunkt ist keine Mutation, aber weist auf DNA-Schädigung hin, z.B.: DNA-Addukte (Erfassung mittels Massenspektrometrie LC-MS/MS oder 1H-NMR-Spektroskopie): gibt ungefähre Anzahl, wie viel DNA-Addukte genotoxisch wirken --> LC-MS/MS sehr sensitive und spezifische Erfassung ausgewählter DNA-Addukte, aber Aufbau ist sehr aufwendig DNA-Brüche (Comet-Assay = Einzelzellgelelektrophorese) DNA-Reparatur-assoziierte Endpunkte (UDS-Test = unplanmäßige DNA-Synthese) Rekombinations-assoziierte Endepunkte (z.B. SCE-Test = Schwesterchromatidaustausch)
- Aufbau einer 2-Jahres Studie zur Kanzerogenität: zwei Probleme bei diesen Studien beschreiben =kanzerogenes Potential einer Substanz wird untersucht Tiere werden lebenslang einer Testsubstanz ausgesetzt, d.h. 7. Lebenswoche bis etwa 24 (Ratte) oder 18 (Maus) Monate währenddessen gelten GLP Aufbau 2-3 Dosisgruppen und Kontrolle: zwei Spezies, beide Geschlechter und 50 Tiere/Dosis/Geschlecht benötigt max. tolerierte Dosis wird als höchste Dosis festgelegt Vorgehen Datenaufnahme (klinische Symptome, KG, Nahrungsaufnahme) Analysen (Testsubstanz und Metabolite, Nekropsie, Hämatologie, Histopathologie, klinische Chemie) Probleme/Nachteile Exposition der Tiere ≠ menschliche Belastungssituation (viele Individuen, geringe Dosen, lange Zeiträume) Spezies-Unterschiede Problem: Überlappung der Tumorbildung mit Alters-gemäßer Gewebedegeneration und spontanen Tumoren Übertragbarkeit der Dosis-Wirkungsbeziehungen auf Menschen ist eingeschränkt
- Was ist die "good laboratory practice"? Qualitätssicherungssystem, das sich mit dem organisatorischen Ablauf und den Rahmenbedingungen befasst unter den Rahmenbedingungen werden nicht-klinische gesundheits- und umweltrelevante Sicherheitsprüfungen geplant, durchgeführt und überwacht dazu gerhört Aufzeichnung, Archivierung und Berichterstattung der Prüfungen (GLP-Grundsätze der OECD, EU, Deutsches Chemikaliengesetz Paragraph 19a,d) Weltweite Implementierung und gegenseitige Anerkennung der Prüfdaten internationale Qualitätssicherung und Qualitätsmanagement Beitrag zum Gesundheits- und Umweltschutz Reduzierung der Tierversuche um bis zu 70% Anwendung:– Arzneimitteln– Pflanzenschutzmitteln und Bioziden– Kosmetischen Produkten– Industriechemikalien– Lebensmittel-/Futtermittelzusatzstoffe
- Wie wird die Belastung mit gentoxischen Stoffen bestimmt? Berechnung von margin of exposure = MOE MOE= Dosis, die bei Tieren zu Tumoren führt Aufnahmemenge des Menschen Zähler: Grundlage der tumorigenen Dosis ist die Dosis-Wirkungsbeziehung aus einerKanzerogenitätsstudie Kennzahlen: BMD10 (Benchmark Dose) , BMDL10 (Benchmark Dose Lower Bound) Nenner: Die Aufnahmemenge des Menschen (Exposition) ist schwierig zu ermitteln – Hochverzehrer vs. Niedrigverzehrer– stark schwankende Inhalte bestimmter Kanzerogene z. B. in Pflanzen
- Vorteile von Kanzerogenitätsstudien Menschen-ähnlicher Stoffwechsel --> Resultate von Kanzerogenitätsstudien erlauben Schlüsse auf Risiken für den Menschen 'ganzes Körpersystem' --> ein tumorigener Effekt eines in der Leber aktivierten Kanzerogens ist auch in anderen Körperteilen zu beobachten Kontrolle der experimentellen Bedingungen relativ gut Elimination aller Verzerrungsfaktoren
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