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Ernährungstoxikologie (Subject) / Einheit 3 (Lesson)
- Welche Formen von Mutationen + Testverfahren gibt es? Genmutationen als Endpunkte: Substitutionsmutationen (Austausch einer einzelnen Base; häufigster Fall) Rasterschub (Frameshift)-Mutationen (Insertion oder Deletion von ein oder mehreren Basen) Deletion, Insertion oder Inversion größerer Abschnitte Vorwärts / loss of function Mutation (viele unterschiedliche Sequenzänderungen führen zum Ziel) Reversion / gain of function Mutation (nur wenige, spezif. Sequenzänderungen führen zum Ziel) Strukturelle Chromosomenmutationen / -aberrationen werden durch Klastogene induziert Änderungen in der Struktur von einem oder mehreren Chromosomen durch Deletion, Duplikation, Inversion, Translokation → implizieren Doppelstrangbrüche!) Erfassung durch 1.) Meistens phänotypische Erfassung anhand der veränderten Funktion eines Gens, - Anhand der Farbe/Färbbarkeit, z.B. bei lacZ-Gen in Muta-Maus: Bildung eines blauen Farbstoffs durch funktionale β-Galactosidase bzw. keine Färbung bei Defekt des lacZ-Gens- Selektion, z.B. Ames-Test: Ausgangsbakterien mit Defekt im Histidin-Operon wachsen nicht auf Histidin-freien Nährböden bzw. Reversionsmutanten wachsen. Weiteres Bsp.: HPRT-Test 2.Nachträgliche Sequenzierung und Genotypisierung von Mutanten 3.) Tests zum Erfassen von Klastogenen: Chromosomenaberrationstest (CAT), Thymidinkinase (TK)- Genmutationstest, Mikrokerntest (MKT)
- Was ist der S9-Mix, wie wird er hergestellt? Warum fehlen einige Substanzen? Aktivitäten? = Externes Biotransformationssystem für in vitro Tests(zur Simulation einer Leber): Der Leber-S9-Mix ist eine Mischung aus mehreren Leberenzymen und besteht aus der S9-Fraktion + NADPH (Cofaktor für CYP) - CYP ist wichtig, da es das Hauptenzym für die Oxidation körperfremder Stoffe in der Leber darstellt S9-Fraktion = Mikrosomenfraktion: ist der postmitochondriale Überstand (Supernatant) von Gewebehomogenaten (i.d.R. Leber), die bei 9000 x g zentrifugiert wurden Microsomen enthalten Phase I CYPs; Cytosol enthält Phase II Transferasen Gewebe ist meistens Rattenleber, die mit Enzyminduktoren vorbehandelt wurde stark aktiviert werden u.a. CYP1A und CYP2B für den Fremdstoffmetabolismus da die metabolisch-aktiven Enzyme in Bakterien sehr von den Säugetieren abweichen, wird der S9-Mix zum Ames-Test zugefügt, um den Metabolismus der Testsubstanz zu simulierenaber: keine direkte Extrapolation zwischen Ratten- und Menschen-CYPs möglich!- es fehlen Kofaktoren wie PAPS und UDP-Glucuronsäure ist einfach und billig liefert aber nur einseitige metabolische Leistungen einige Metaboliten erreichen Zielzellen nicht
- Ames-Test: Berücksichtigung (welche Enzyme werden berücksichtigt und welche nicht?) und Besonderheit des Fufurylalkohols im Ames-Test. Enzymatische Ausstattung des S9-Mix ≠ Leberzellen (Phase II Enzyme sowie PAPS + UDP-GS fehlen), dS9-Mix dient nur der metabolischen Aktivierung Knockout endogener Fremdstoff-metabolisierender Enzyme der Bakterien ist möglich (z.B. Acetyltranferase und Nitroreduktase), um Ergebnis besser auf Mensch übertragen zu können außerdem entwickelt man die Expression humaner Fremdstoff-metabolisierender Enzyme wie NAT, SULT, GSCYPs, EtHO- und Aldehyd-DH weiter z.B. Ames-Test bei Furfurylalkohol in Salmonellenstamm, die humane SULT1A1 exprimieren: Substanzwird metabolisiert und in reaktiven Sulfatester umgewandelt Bildung DNA-Addukte! Im Elternstamohne hSULT nicht beobachtet! außerdem: Die Methylfuran-Addukte werden im TV nachgewiesen.
- Was ist der Ames Test? nach seinem Erfinder Bruce Ames benannt Test, der das mutagene Potenzial verschiedener Chemikalien (Experiment vs. Kontrolle) misst Mischung des pot. Mutagens mit Bakterienzellkultur - Salmonella mit KO des Enzyms zur Histidinsynthese --> sollten auf histidinfreiem Medium nicht überlebensfähig sein! Kontrolle: ohne mutagen, selbige Bedingungen Inkubation mit Rattenleberextrakt sog. Revertanten machen Rückmutation durch und können danach ohne Histidin wachsen --> Medium trotzdem kolonisiert Mutagene erhöhen Frequenz der Rückmutation --> Vergleich der Kolonien mit jenen der unbehandelten Kontrolle Erstes Screening, ob die Substanz potentiell mutagen ist
- OECD 471 um eine Substanz zuzulassen, muss sie natürlich vorher getestet werden -> Richtlinien für die durchzuführenden Tests Fünf Teststämme Defizient für DNA-Excisionsreparatur Fehlerhafte DNA-Reparatur Funktion "undichte” Zellwände
- Was ist der Micronucleus Test? Nachweis gentoxischer Wirkungen auf Säugerzellen in-vitro Dazu ist Beobachtung der Interphase d. 1. Mitose nach Behandlung entscheident! --> Detektion struktureller + numerischen Chromosomenschäden treten dort Chromosomenaberrationen + Störungen im Spindelapparat auf : Chromosomen während Zellteilung nicht in den Zellkern der Tochterzelle eingebaut die Partikel bilden sog. Micronucleus im Cytoplasma MN werden in der Interphase der ersten Mitose nach Behandlung ausgewertet 2000 werden gezählt für MN Toxikologischer Endpunkt: Frequenz der MN-haltigen Zellen
- Was sind Chromosomen Aberrations-Tests? Nenne Varianten von Chromosomenschäden! Ziel: Identifikation von Agentien, die strukturelle und numerische chromosomale Aberrationen in kultivierten Säugerzellen auslösen Inkubation mit Testsubstanz in Anwesenheit und Abwesenheit von S9 Mix (Aberrationen können das Chromosom oder das Chromatid betreffen) Behandlung mit Spindelgiften: Akkumulation von Metaphasen Präparation von Metaphasen zu bestimmten Zeitpunkten Analyse der Chromosomenschäden in erster Mitose nach Inkubation 2x100 Metaphasen pro Konzentration werden ausgezählt Toxikologischer Endpunkt: Frequenz der Zellen mit einemoder mehrerer Chromosomenschäden Lücke Bruch Austausch
- Was ist der Comet assay? Indikatortest für DNA-Schäden – nicht für Mutagenität: Messung von populationsweiter Reaktion auf DNA-Schäden und -Reparatur alle Zellen mit ZK, für spez. Fragestellungen geeignet Zellkultur kommt in Kontakt mit pot. mutag. Substanz! --> einzelne Zellen " pot. beschädigte DNA" auf Objektträger in Agarose eingebettet, Anfärbung --> Lyse --> Elektrophorese :Bruchstücke teilen sich der Größe nach auf, bruchstückhafte DNA wandert aus ZK heraus--> UV-Mikroskop beschädigten Zellen wirken durch ihren Schweif aus DNA Bruchstücken wie ein Komet Unter alkalischen Bedingungen (pH>13) Detektion von:– DNA-Einzel- und Doppelstrangbrüche– Einzelstrangbrüche aufgrund von alkali-labilen Stellen– Nucleotide Excision RepairGrad der DNA-Schädigung korreliert mit der Länge und der Intensität der fragmentierten DNA, die ausserhalb des Kerns migiriert und sichtbar wird (Komentenschweif)
- Was ist Gentoxizität, was ist Mutagenität? Gentoxizität: schädliche Wirkung von Substanzen auf die genetische Integrität einer Zelle, muss nicht mutagen sein Mutagenität: verarbbare/permanente Veränderung der Nukleotidsequenz eines Genoms; betrifft Gene, Chomosomen, Genommutationen, ist immer auch genotoxisch
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