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Bioanalytik (Subject) / Elektrophorese (Lesson)
- Erläutern Sie die geschichtliche Entwicklung der Elektrophorese - 1930 Trennung von Kolloiden in einer Trägerflüssigkeit in einem elektrischen Feld von Arne Tiselius, Apparatur 1937 veröffentlicht. - Später gelang es, Serum elektrophoretisch aufzutrennen und damit nachzuweisen, dass Proteine nicht nur Kolloidaggregate sind. - 1940-1955 Verwendung von Stärkegelen durch Oliver Smithies
- Worauf beruht das allgemeine Trennprinzip der Gelelektrophorese? - geladene Teilchen unterschiedlicher Größe wandern im elektrischen Feld unterschiedlich schnell. - kann sowohl in Kapillaren als auch mit stabilisierenden Matrices wie Gel oder Membran durchgeführt werden. Hierbei erfolgt Trennung nach Ladung und Größe.
- Was sind die theoretischen Grundlagen der Elektrophorese? - Wanderungsgeschwindigkeit v = u * E, wobei u die substanzspezifische elektrophoretische Mobilität ist und E die Feldstärke. - Bremsend wirken Reibungskraft, Retardationskraft und Relaxationskraft. - Die Reibungskraft kann für kugelförmige Teilchen mit Hilfe des Stokesschen Gesetzes berechnet werden. Bei Proteinen gibt es einen empirischen Zusammenhang zwischen Mobilität u und Molekülmasse. - Bei pH-Werten von über 7 werden Siliziumoxide in Gel und auf der Glasoberfläche negativ geladen und ein elektroosmotischer Fluss wirkt der Elektrophorese entgegen
- Nennen Sie Fakten zu Gelsystemen. - Polyacrylamidgele werden durch Polymerisation von Acrylamit und Methylenbisacrylamid hergestellt, wobei das Verhältnis die Porengröße bestimmt. - Vorteile: Gele sind stabil und klar, haben fast keine Elektroendoosmose, sind kompatibel mit vielen Färbemethoden und können leicht aufbewahrt werden - Nachteile: Die Monomere sind toxisch und die Porengröße ist limitiert (unter 800 kDa), basische Gele können aufgrund von Hydrolyse nur kurz gelagert werden. - SDS zerstört alle nichkt kovalenten Wechselwirkungen in den Proteinen und überdeckt ihre Eigenladung. Mercaptoethanol dient dem Aufbrechen von Disulfidbrücken.
- Welche Färbemethoden gibt es? - Färbung vor und nach Trennung möglich. - Untersuchung von Proteinmenge, Phosphorylierung und Glycosilierung möglich. - Coomassie, Silberfärbung (Schlusspunktbestimmung), Krypton - Farb-Multiplexing
- Was ist eine isoelektrische Fokussierung? - Proteine werden nach ihrem relativen gehalt an sauren und basischen Aminosäuren aufgetrennt - es wird kein SDS zugesetzt - über das Gel liegt ein pH-Gradient an - Proteine wandern zu jenem pH-Wert, der ihrem pI entspricht. An diesem Punkt beträgt die Netoladung des Proteins 0, weshalb es nicht weiter wandert. - kann zur 2D-Gelelektrophorese eingesetzt werden. Zunächst wird horizontal eine IEF durchgeführt, die dann mit einer vertikalen SDS-PAGE kombiniert wird. Dadurch wird eine hochauflösende Trennung komplexer Proteingemische möglich. Wird z.B. für vergleichende Proteinexpressionsanalyse eingesetzt.
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