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Enzyme (Subject) / Thermophile (Lesson)
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- Bis zu welcher Temperatur ist Leben möglich? - Wasser nur bis 100° flüssig. - Bei Überdruck deutlich höher - max.: 122°C, Methanopyrus - 140-150° angenommen
- Lebensräume von Thermophilen - Orte mit vulk. Aktivität: heisse Quellen, dampfende Quellen/vulkanische Exhalation, Hydrothermalquellen auf dem Meeresgrund - Solfataren: Schwefelaustritt, acidophile Schefelverwerter - heisse Quellen: neutral/basisch, Chlorid- und Carbonatreich, Temperatur variabel - heisse Böden: durch Sonnenlicht 50-70°C, an der Küste kann durch verdunstung hohe Salzkonzentration hinzu kommen. - marine Lebensräume: Hot Water Beach Neuseeland, Hydrothermalquellen vor Galapagos - Erdöllagerstätten und heisse unterirdische Wasservorkommen. Leben bis 10000 m möglich und bis 5278 nachgewiesen. Aquifere, Goldminen - anthropogene Habitate: Silos, Kühlwasser, Boiler
- Wissenswertes - Viele Vertreter bei Archeae - Extreme Thermophilie und Acidophilie schließen sich aus - Thermophilie 45-80°C - Bestimmung der Temperaturoptima durch V-Muster - Archaea sind die thermotolerantesten. Phototrophe allgemein weniger thermotolerant
- Anpassungen der Thermophilen: RNA - Denaturierung durch Auflösung der glykosidischen bindung zw. Zucker und Base. Deaminierung, Alkylierung von Basen, Depurinierung und Oxidation von Base/Zucker. Erhöht außerdem Gefahr durch andere Stressoren. - erhöhter GC-Gehalt in rRNA und tRNA. Kosnervierung von Adenin und Uracil in für Erkennung wichtigen Teilen des Moleküls. - Verwendung anderer Codons: GGC statt CGC, weil GG:CC-Helix stabiler ist. - Verbesserung des Translationsprozesses im Hinblick auf Effizienz und Genauigkeit
- Stabilisierung von Nukleinsäuren durch Ligandbindung Na+, K+ und Ca2+ schützen DNA vor Thermodegradation - hohe Konz. monovalenter Kationen schützen auch RNA - Salze und Mg2+ fungieren als Gegenionen zum Schutz negativ geladener Phosphatreste. Schutz auch durch Polyamine. Je länger die Kette desto besser. - verzweigte Polyamine - posttranskriptionell modifizierte Nukleoside in der stabilen RNA. Mehrfache Methylierungen erhöhen die Konformationsrigidität - DNA = hypermodifizierte RNA - Anstieg des GC-Gehaltes + kationische Liganden f+ührt zu einer kompakteren Struktur von dsDNA und dsRNA - spezielle DNA-Gyrasen bei Thermophilen sorgen für besonders stabile Verpackung durch negatives Supercoiling - Bindeproteine (Histon-ähnlich) machen DNA kompakter. In Thermophilen stärkere Interaktionen mit Proteinen im Ribosom.
- Reparatur von Nukleinsäuren - DNA-Methyltransferasen, DNA-Glycosylasen, Endonukleasen, 5'-3'-Exonukleasen, Ligasen, Polymerasen - Hyperthermophile dadurch auch resistent ggü. Strahlungsschäden - Nutzung von 4-Methylcytosin, da Cytosin und 5-Methylcytosin deaminiert werden können. - Bruch der glycosidischen Bindung und Bruch der Phosphodiesterbindung werden durch effiziente Reparaturmechanismen behandelt. - Schutz vor Denaturierung: Salze und Polyamine, Proteinbindung, Supercoiling durch Polyamine und Gyrasen, Zirkularisierung, hohe Kopienanzahl für homologe Rekombination
- Thermostabilisierung von RNA - Deaminierung und Depurinierung: Modifikation von Basen und Ribose - Denaturierung: Salze, Polyamine, erhöhter GC-Gehalt, Basenmodifikation, kompakte Form und Faltung schützen vor Degradierung, de novo-Synthese kaputter RNA, RNA-Bindeproteine, Chaperone bei RNA-Reifung
- Proteine in Thermophilen - kaum Änderungen - ein paar Substitutionen - mehr ionische Bindungen zw. Sauren und basischen AS - stark hydrophobes Inneres - Faltung thermophiler Proteine benötigt ebensolche Umgebung
- Chaperone bei Archaea - nascent polypeptide associate complex (NAC): Schützt naszierende Polypeptidstränge vor Aggregation und Falschfaltung - prefoldins: führen Proteine ATP-abhängigen Chaperonen zu - kleine Hitzeschock Proteine: sog. Holdasen, schützen Proteine, die zur Degradation neigen - Group I Chaperone, ATP-abhängiges Proteasom (nur 2-4 UE), HSP60
- Rubredoxin - hitzestabilstes Protein (200° C), Pyrococcus furiosus - Detoxifikation von Superoxid (ohne O2) über Superoxidreduktase - reduziert oxidierte SOR - reduziert Superoxid zu H2O2 - finales Reduktionsmittel: NADPH - durch aromatische Reste im Zentrum extrems tabil - für Faltung ist die Koordination von Eisen essentiell
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- Probleme beim Stoffwechsel in Thermophilen - geringe halbwertszeit von Biomolekülen in wässrigen Milieus bei hohen Temperaturen - betroffen: phosphorylierte Intermediate im Glucosemetablismus, Indol und Phosphoribosyl-Anrthanilate in der Tryptophansynthese, Carbamoylphosphat in der Biosynthese von Arginin und Pyrimidin - weitere Problem: Energieverlust und Bildung toxischer Intermediate
- Anpassungen des Glucosemetabolismus NADPH und ATP rel. instabil GAP und PEP extrem instabil Embden-Meyerhof-Weg und Entner-Doudoroff-Weg oder Kombination möglich beim Glucoseabbau Intermediate sind konserviert, aber viele Anpassungen der SW-Wege inklusive neuer Enzymfamilien Pyrococcus furiosus: Pyruvat Ferrodin Oxireductase, ADP-bildende Acetyl CoA-Synthetase; Verwendung von ADP statt ATP und Umgehung von Reduktionsäquivalenten über Ferredoxin; reduziert Protonen statt Susbtrate Sulfolobus solfataricus (ED-Weg): sowohl nicht- als auch semi-phosphorylierender Weg. Glucose wird direkt zu Gulconat umgesetzt, nur einer statt zwei Schritte; KEINE ATP-Produktion in ED-Weg. Besitzt auch EMP-Weg (Glycolyse). Bei allen thermophilen Archaea ist der EMP-Weg nicht reguliert
- Anpassungen der Tryptophansynthese wird in 7 Schritten aus Chorismat gebildet Phosphoribosyl-Antranilat und Indol sehr labil und über Zellmembran flüchtig metabolic channeling: direktes Channeling, nachbarschaftlich oder über Enzym clustering P. furiosus: Bildung des alpha/beta-Komplexes mit der Tryptophan-Synthase als Ausgangsstoff verhindert Indol-Verlust. Thermotoga maritima: zweite Tryptophan-Synthase-UE TrpB2 dient als Rettungsweg für freies Indol, bindet aber nicht an TrpB1 Phosphoribosyl-Antrahnilat hat eine sehr niedrige HWZ von 39s, dem wird durch die hohe katalytische Effizienz der Phosphoribosyl-Anthranilat-Isomerase entgegen gewirkt. Phosphoribosyl-Pyrophospat-Transferase: weniger effizient als bei Mesophilen, aber hohe Substrataffinität Ammoniumverlust bei Synthese von Anrthanilat aus Chorismat und Glutamin wird durch Ammonium-Channelling verhindert
- Anpassungen beim Carbamoylphosphat toxisches Intermediat: Cyanat, kann freie Aminogruppen carbamoylieren metabolic channelling
- Kompatible Solute AS, Zucker, Polyole, betaine und Ectoine bei Halophilen und Hyperthermophilen sog. Hypersolute oft negativ geladen: Hexosederivate mit OH-Gruppe am C1-Atom und Polyol-Phosphodiester Hypersolute werden eher aufgenommen als synthetisiert Bundung der Solute an Peptidbindungen, verstärken Proteinstrukturen, maximaler Ausschluss der Hypersolute von richtig gefalteten Proteinen
- Mikrobielle Membranen Lyotrop und Thermotrop Ziel bei Veränderung: homeoviscous adaptation Fluid Mosaic Model Anpassungen: Viele gesättigte Fettsäuren -> noch hydrophober, Mono- statt Bilayer erhöht Schmelztemperatur
- Biotechnologische Anwendungen der Proteine von Thermophilen Polymerasen für PCR Chimärenproteine Produktion von Biokraftstoffen Nahrungsmittelindustrie
- Polymerasen für PCR Thermus aquaticus (50-80°C): Taq-Polymerase, schnell aber fehleranfällig DeepVent, Pfu: langsamer Kod-Polymerase (Thermococcus kodakaerensis): schneller als Taq und deutlich geringere Mutationsrate