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Mikrobieller Abbau (Subject) / Abbauj von Erdöl (Lesson)

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• Chemische Bestandteile des Erdöls 1. Aliphatische KWST: Isooctan 2. Cycloaliphatische KWST: Cyclohexan 3. aromatische KWST: Benzen 4. NOS-Verbindungen:Pyridin
• Herausforderungen an die Mikroorganismen 1. Hochkomplexes Stoffgemisch 2. toxische, niedermol. KWST 3. KWST wenig oder nicht wasserlöslich
• Transportprobleme - extrazellulär 1. Transport zu den Zellen - Ausscheidung von Biotensiden erhöht Wasserlöslichkeit von n-Alkanen um Faktor 10^4-10^5 - ölpositive mit hydrophober Zelloberfläche treten in Ölphase ein. Glycolipide - ölnegative scheiden Biotenside aus.
• Transportprobleme - über die Membran Aufnahme von Mikrotröpfchen Aufnahme von Makrotröpfchen Aufnahme gelöster Verbindungen Acinetobacter: Membranmikrovesikel 20-50 nm Hefe: Poren in der Zellwand
• Transportprobleme - intrazellulär - passive Diffusion
• Abbau aliphatischer KWST - Methan -  keine C-C-Bindung - Schlamm, Sümpfe, Pansen, Darm, Erdgas, Kohleformationen - Methanotrophe: obligate C1-Verwerter, obligate Aerobier, Methanmonooxygenase - nicht-methanotrophe Methylotrophe: keine obligaten C1-Verwerter, Nutzung org. Säuren, Ethanol, Zucker - da C1 reduzierter ist als CO2, sind diese Bakterien nicht autotroph
• Aerober Abbau von Methan - CH4 + O2 -> CH3OH +  H2O -> HCHO -> Biomasse - Methanmonooxygenase - Methanotrophe Typ 1: Ribulosemonophosphatweg EFFIZIENTER - Methanotrophe Typ II: Serinweg
• Anaerober Abbau von Methan - Oxidation mit Nitrat, Nitrit und Sulfat - Sulfat: Symbiose methanotropher Archeen mit sulfatreduzierenden Bakterien, CH4 + SO4 -> HCO3 + HS + H2O - Nitrat: Nur in Co-Kultur mit Anammnox-Bakterien kultivieren, die Nitrit aus dem Medium entfernen, CH4 + 4 NO3 -> CO2 + 4 NO2 + 2 H2O - Nitrit: Konsortium koppelt Methanoxidation an Denitrifikation,1. Methanoxidation mit Nitrat durch ANME-Bakterien, 2. Methanoxidation mit Nitrit durch Methylomirabilis. BEIDE PARTNER OXIDIEREN METHAN. 3 CH4 + 8 NO2 + 8 H+ -> 3 CO2 + 4 N2 + 10 H2O
• Verwertung von KWST - C2-C4: gasförmig, Pseudomonas und Candida - C5-C8: flüssig, wenig Wachstum da stark toxisch, Integration in Zellmembran - C9-C20: fest, gutes Wachstum, Anpassung an Wachstum auf hydrophoben Substraten
• Funktionalisierung des Alkans - Hydroxylierung - wichtige Enzyme: Methanmonooxygenase, Alkanhydroxylase, Cytochrom-P450-Monooxygenase - Alkanhydroxylase: Rubredoxinreduktase, Rubredoxin, Membranmonooxygenase, NADH2 -> NAD - Cytochrom-P450-Monooxygenase. Cofaktor FAD - Terminale oder subterminale Oxidation -> biologische Baeyer-Villiger-Oxidation -> ß-oxidation d. Carbonsäuren.
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• Anaerober Abbau aliphatischer KWST - Nitrat oder Sulfat als Elektronenakzeptoren - Wachstum erheblich langsamer - nur geringe Zahl an n-Alkanen werden gentuzt - 2 Abbauwege
• Abbau verzweigter Alkane - Abbau durch unverzweigte KWST reprimiert - Zunahme sterischer Behinderung der Enzyme durch mehr Verzweigungen.
• Abbau alicyclischer KWST - Erdöl, Blätterwachs, Pflanzenöle - Insektizide, Pestizide - Verwertung cometabolisch und in Mischkulturen, als Wachstumssubstrat nur von Spezialisten wie Nocardien
• Oxidationswege KWST 1. subterminale Oxidation (Alkan- bzw. Cycloalkan-Hydroxylase) 2. Alkohol -> Keton (Alkohol-Dehydrogenase, Cyclohexanol-Dehydrogenase) 3. Keton -> Ester (Alkanon-/Cyclohexanon-Monooxygenase) = e-Caprolacton bei Cyclohexanon
• Baeyer-Villiger-Oxidation - Cyclohexanon + O2 +  NADPH2 -> Cyclischer Ester + H2O + NADP (1,2-Cyclohexanon-Monooxygenase)
• Eigenschaften der Cyclohexanon-Monooxygenase 1. Eine oder mehrere Untereinheiten 2. NADPH2 als Cofaktor 3. Prosthetische Gruppe: FAD 4. pH-Optimum: 7-9 5. breites Substratspektrum bei Ketonen, daher sehr umweltrelevant
• Abbau normaler unc cyclischer Ester - Ester -> Hydrolyse mit H2O ->Alkohol -> Carbonsäure -> ß-Oxidation - cycl. Ester + e-Caprolacton-Hydrolase -> Carbonsäure mit OH -> Adipinsäure -> ß-Oxidation
• Vorraussetzung für das Wachstum auf cycloaliphatischen Substraten 1. Enzymsystem für subterminalen Angriff 2. Monooxygenase für Ringspaltung 3. Enzymsystem zur Verwertung von Dicarbonsäuren 4. Toleranz ggü. Substrat 5. Aufnahme in die Zelle
• Eigenschaften der Cycloalkanverwerter 1. kein Wachstum auf n-Alkanen 2. sehr langsames Wachstum 3. Phönotyp ä#hnlich den Alkanverwertern 4. kommen nur in kontaminierten Böden vor
• Oxidation von Methylcycloalkanen - Bei Oxidation des Ringes dead End - Oxidation d. Methylgruppe -> Carbonsäure + Alkohol
• Abbau von Cycloalkancarbonsäuren - einfache Isolation entsprechender Mikroorganismen aus Boden, Wasser, Schlamm - Abbau über Acyl-CoA-Synthethase und meistens ß-Oxidation
• Allgemeine Prinzipien des Abbaus aliphatischer und cycloaliphatischer Verbindungen 1. langkettige KWST werden eher abgebaut als kurzkettige 2. unverzweigte ggü. verzeigten becorzugt 3. aliphatische sind besser als cycloaliphatische (Enzymsysteme für subterminalen Angriff, Ringspaltung und Abbau von Dicarbonsäuren) 4. bereits oxidierte Verbindungen werden besser abgebaut als die entsprechenden Aliphaten und Cycloaliphaten (hydrophiler, Enzyme für initiale Hydroxylierung nicht nötig.)
• Vorkommen aromatischer KWST Lignin, Farbstoffe, Toxine, Aminosäuren, sek. Metaboliten Benzen, Toluen, Brennstoffe, Sprengstoffe, Polymere
• Beispiele für induktive Effekte -I-Effekt (desaktivierend): NO2, SO3H, COOR, F, Cl, OH +I-Effekt (aktivierend): C(CH)3, CH(CH3)2, CH3, O-, OR
• Mesomerer Effekt -M und -I = meta-dirigierend: COOR, COOH, NO2, SO3H schwach: (desaktivierend) +M und -I = ortho/para-dirigierend: O-, OR, OH, NH2, C6H6, C(CH3)3 (aktivierend), schwach F, Cl
• Abbau aromatischer KWST - verläuft nach dem Prinzip der elektrophilen Substitution, da Kern nucleophil - beginnt mit Hydroxylierung - Abbau abh. von: I- und M-Effekt der Substituenten, Anzahl und Anordnung der arom. Ringe, Umgebungsfaktoren
• Ablauf der arom. Ringspaltung 1. Hydroxylierung 2. Ringspaltung 3. Abbau der Spaltprodukte zu Intermediaten des Stoffwechsels konvergente Abbauwege: Catechol und Protocatechinsäure
• Transformation von 4-Hydroxyphenylpyruvat 4-HPP mit 4-Hydroxyphenylpyruvatdioxygenase + O2 -> Homogentisinsäure (1,4-Diol) mit NIH-Shift zu Pos. 2 auch 4-HPP -> 4-Hydroxymandelsäure bei Hydroxylierung der Seitenkette + CO2 1. Sauerstoffaktivierung 2. Angriff des aktivierten Sauerstoffs am Phenylring 3. Seitenkettenmigration 4. Rearomatisierung
• Monooxygenasen - einfache Proteine mit FAD als prosthetischer Gruppe - Coenzymabhängig: NADH bei Bakterien und nADPH bei Eukaryoten -e-Übertragung über FAD, NADPH liefert e
• Hydroxylierung d. aromatischen Ringes - Bakterien: Dioxygenase -> cis-Dihydrodiol -> (Dehydrogenase) Catechol - Pilze: Monooxygenase -> Epoxid -> Epoxid-Hydrolase -> Trans-Dihydrodiol -> Catechol
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• bakterielle Dioxygenase - komplexes Enzym mit heterologen Untereinheiten - HYdroxylasefunktion - NADH2 als Coenzym - breites Substratspektrum - Redukase, Ferredoxin, terminale Oxygenase
• Monooxygenase (Pilze) - Cytpchrom-P450-Monooxygenase - NADPH2 als Coenzym - einfache Enzyme mit Hydroxylasefunktion
• Allgemeine Prinzipien des Abbaus aromatischer Verbindungen - konvergente Abbauwege - 1,2 oder 1,4-Diolstruktur ist grundlegende Voraussetzung für RIngspaltung durch Dioxygenasen - ortho-Spaltung _> cis,cis-Muconsäuren - meta-Spaltung -> 2-Hydroxymuconsäurealdehyd - Gentisinspaltung -> oxo- oder Dicarbonsäuren - Ringspaltungsreaktionen sind mit katabolen Abbauwegen verknüpft - Endprodukte gehen in den Intermediärsoffwechsel
• Anaerobe Abbauwege - große Herausforderung, ist dennoch in nahezu allen physiologischen Klassen anzutreffen - Beispiele: Kopplung von Toluen an Fumarat, O2-unabhängige Hydroxylierung von Ethylbenzen - -
• Polycyclische aromatische KWST - linear: Naphthalen, Anthracen - angular: Phenanthren - geclustert: Pyren
• Quellen der PAK-Verbreitung - Verbrennung fossiler Brennstoffe, Müll, Holz - Nebenprodukte aus industriellen Prozessen und Nahrungsmittelherstellung
• Eigenschaften von PAK - geringere Stabilisierung pro Ring (Clar-Regel) -> höhere Reaktivität - schlecht wasserlöslich, daher sehr persistent in Wasser, Boden und Sedimenten - nach Aktivierung karzinogen
• Abbauwege von PAK - Bakterien: Naphtalin -> meta-Ringspaltung -> Catechol -> CO2 - Weißfäulepilze: PAK-Chinon (über ligninolytisches System) -> CO2 - Anthracen -> meta-Ringspaltung -> Catechol -> CO2 - Pyren: O in der Mitte und OH/COOH an C1. Ringspaltungsprodukte: Phthalsäure und Zimtsäure
• Ablauf aerober Abbau von PAK 1. Primäroxidation durch Oxygenasen 2. Rearomatisierung durch Dehydrogenasen 3. Ringspaltung 4. Transformation der Spaltungsprodukte zu Hydroxycarbonsäuren 5. Decarboxylierung zum Diol 6. sukzessive Ringspaltungen bis zum vollständigen Abbau 7. Rezyklisierungen und Nebenreaktionen bei komplexen PAK erfordern mehrere Abbauwege
• Bildung - aktivierter - karzinogener PAK 1.DIhydrodiolexpoxidmechanismus 2. Radikalkationenmechanismus 3. Chinonmechanismus 4. Benzyloxidationsmechanismus
• Anaerober Abbau von PAK - Anreicherungs- und Reinkulturen - methanogene, Sulfat- und Nitratatmer - Beispiele: Kopplung von Methylnaphtalin an Fumarat, Carboxylierung von Naphtalin

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