Pflanzenphysiologie (Subject) / Knoop (Lesson)

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• Embryophyta Landpflanzen
• Bryophyta Laubmoose, Abteilung
• Anthocerotopsida, Marchantiopsida, Bryopsida (Funariidae, -anae) Klassen der Laubmoose Hornmoose - Anthocerotopsida Lebermoose - Marchantiopsida Laubmoose - Bryopsida
• Lyco(podio)phyta Bärlappgewächs
• Lyco(podio)phyta Bärlappgewächs
• Monilophyta („Moniliformopses“) Farne
• Equisetopsida /-phyta Schachtelhalmgewächse
• Psilotopsida Echte Farne
• Psilotopsida Gabelblattgewächse / Natternzungengewächse
• Spermatophyta Samenpflanzen
• Coniferopsida/-phyta Klasse von Samenpflanzen. Zu ihnen zählen die rezenten Koniferen
• Ginkgopsida/-phyta Ginkgogewächse
• Cycadopsida/-phyta Palmfarne
• Gnetopsida/-phyta Gnetales
• Gnetopsida/-phyta Gnetales
• Magnoliophyta Bedecktsamer
• Basale Dikotyle Zweikeimblättrige
• Liliopsida (Monokotyle) Einkeimblättrigen
• Was will der Molekularbiologe? • Gene isolieren, also „klonieren“.• Gene (oder ganze Genome) sequenzieren.• Die Expression der Gene charakterisieren & verstehen Wie ist der Promotor des Gens reguliert? Wann ist wo wie viel mRNA und Protein vorhanden ?• Die Genprodukte charakterisieren.In welchen Geweben und wo in der Zelle ist das Protein ? Was genau macht es dort ?• Die Expression von Genen verändern.Andere Mengen, in anderen Geweben, zu anderen Entwicklungszuständen.• Gene in verändertem Kontext exprimieren.In anderen (transgenen) Spezies, in andere Kompartimente.
• Was will der Molekularbiologe? • Gene isolieren, also „klonieren“.• Gene (oder ganze Genome) sequenzieren.• Die Expression der Gene charakterisieren & verstehen Wie ist der Promotor des Gens reguliert? Wann ist wo wie viel mRNA und Protein vorhanden ?• Die Genprodukte charakterisieren.In welchen Geweben und wo in der Zelle ist das Protein ? Was genau macht es dort ?• Die Expression von Genen verändern.Andere Mengen, in anderen Geweben, zu anderen Entwicklungszuständen.• Gene in verändertem Kontext exprimieren.In anderen (transgenen) Spezies, in andere Kompartimente.
• Modellpflanze 1: Arabidopsis thaliana • Brassicaceae, echte dikotyle Blütenpflanze• Sehr kleines, kompaktes Genom>> seit 2000 komplett sequenziert:etwa 25.000 Gene in 120 MBp*auf 5 Chromosomen• kurze Generationszeit: ~ 6 Wochen• gut beschriebene Genetik(„selbstend“), leicht kreuzbar• großer Samenansatz• große Ökotypensammlung• kleine Pflanze, dadurch sehr gewächshaus- und labortauglich,z.B. für groß angelegte „Screenings“• gut über Agrobacterium tumefaciens transformierbar
• Genomgrößen (& das c-value paradoxon) Bei 25000 Genen = 4800 Bp Platz / GenEin durchschnittliches Protein von 500 Aminosäuren beansprucht1500 Bp codierende RegionDer Rest entfällt auf Introns, die Promotoren, die flankierendentranskribierten Regionen und die intergenischen Bereiche
• Modellpflanze 2: Reis, Oryza sativa • Als extrem wichtige Nutzpflanzedie tägliche Nahrungsgrundlage vonmindestens 2,5 Milliarden Menschen.• Seit 2003 ebenfalls komplettsequenziertes Genom (500 MBp)• Als monokotyle Angiosperme von nichtunbeträchtlicher evolutionärer Distanz(>100 Mio. Jahre) zu Arabidopsis.• andere „Modell“-Blütenpflanzen:– Tabak (Nicotiana tabacum)– Kartoffel (Solanum tuberosum)– Tomate (Lycopersicon esculentum)– Mais (Zea mays)– Luzerne (Medicago truncatula)– Sumatrafarn (Ceratopteris richardii)– Löwenmäulchen (Antirrhinum majus)
• Modellpflanze 3: Physcomitrella patens • Ein Laubmoos. Als solches ist derhaploide Gametophyt die grüne Pflanze.• Im Gegensatz zu Blütenpflanzeneffiziente homologe Rekombination, die1.genetische „knock-outs“, genauwie in Hefe, Bakterien oder Maus ermöglicht2.die zielgerichtete Integration eines Transgensan eine bestimmte Stelle des Genomsermöglicht• Genetische Manipulation des Gametophytenmacht sich sofort bemerkbar, weil kein zweitesAllel vorliegt.> Einfache „Phänotypisierung“, z.B. in derEntwicklungsbiologie.• Seit Januar 2008 ebenfalls die kompletteGenomsequenz von 480 MBp publiziert.
• Modellpflanze 3: Physcomitrella patens • Ein Laubmoos. Als solches ist derhaploide Gametophyt die grüne Pflanze.• Im Gegensatz zu Blütenpflanzeneffiziente homologe Rekombination, die1.genetische „knock-outs“, genauwie in Hefe, Bakterien oder Maus ermöglicht2.die zielgerichtete Integration eines Transgensan eine bestimmte Stelle des Genomsermöglicht• Genetische Manipulation des Gametophytenmacht sich sofort bemerkbar, weil kein zweitesAllel vorliegt.> Einfache „Phänotypisierung“, z.B. in derEntwicklungsbiologie.• Seit Januar 2008 ebenfalls die kompletteGenomsequenz von 480 MBp publiziert.
• Agarosegelelektrophorese, Fluoreszenzfarbstoff - Ethidiumbromid interkaliert zwischen die Nukleotidbasen
• PCR - die universelle Revolution, Kary Mullis 1986 Region von Interesse - Flankierende, bekannte Sequenzregionen ca. 20+ nt. (> 7 Aminosäuren) Primer (Oligonukleotide) DNA-Denaturierung, 96°C Hybridisierung (Annealing) ~55°C Synthese 72°C - Taq (Pfu, Pwo,…) Polymerase Mispaarungen sind i.O. für: heterologeAmplifikation, Klonierung, Mutagenese, …
• Transformation von Pflanzen - Agrobakterium tumefaciens Sehr gut für dikotyle Pflanzen, schlecht für andere Sehr effiziente Integration ins Genom
• Transformation von Pflanzen - Beschießen mit DNA Sehr gut für Transformation von Chloroplasten-DNA durch effiziente homologe RekombinationTransformation embryonaler/meristematischer Gewebe möglich, aber ineffizient undProbleme somaklonaler Variation bei Regeneration
• Transformation von Pflanzen - Protoplasten-Transformation Zugabe von DNA Sehr gut für transiente ExpressionSehr einfach durch Koinkubation mit Polyethylenglykol (PEG)Keine effiziente Integration ins Genom.Probleme somaklonaler Variation bei Regeneration
• Pflanzliche Gewebekultur Die homologe Rekombination funktioniert in Pflanzen schlecht (außerim Moos Physcomitrella !). Neu eingebrachte DNA wird in der Regelnicht ins Genom eingebaut. Nur der Weg über die Agrobacterium TDNAführt effizient zu einer Integration ins Genom.Eine Ausnahme ist die Transformation des Chloroplastengenoms.Hier kann effizient mit der „Particle Gun“ gearbeitet werden.Neugen Kan RPflanzliche GewebekulturZur stabilen Transformation wird das neue Genphysisch auf der DNA mit einem Resistenzgengekoppelt, meist der Neomycinphosphotransferase.Die Selektion erfolgt mit Antibiotika wie Kanamycin in der Gewebekultur Pflanzen können im Prinzip aus einer einzigentransformierten Zelle oder aus Protoplastenmit dem Umweg über Kallus regeneriertwerden. Die Selektion ist dann nicht mehrerforderlich.Übrigens: Protoplastenfusionen: Die „Tomoffel“Bei Pflanzen mit großem Samenansatz wieArabidopsis kann die ganze Pflanze ohne denUmweg über die Gewebekultur mitAgrobakterien transformiert werden.
• Agrobacterium tumefaciens erzeugt Wurzelhalsgallen(crown gall tumors) wird nach Verletzung einer (dikotylen) Pflanzenzelle durch die Freisetzung phenolischer Substanzen, z.B. Acetosyringon chemotaktisch angelockt. und transferiert die T-DNA seines Ti (tumor inducing)- Plasmids in das Genom der Pflanzenzelle LB & RB: left and right border sind 25 Bp. Sequenzwiederholungen codiert für die Synthese von Auxinen (tms) und Cytokininen (tmr), die ein Tumorwachstum der Pflanzenzelle erzwingen. codiert für die Synthese von Opinen (z.B. nos, Nopalinsynthetase): Arginin +
  -Ketoglutaraldehyd -->
  Nopalin
• Binäres Vektorsystem DNA wird zunächst in einem Escherichia coli-Klonierungsvektor kloniert. Dann wird das gewünschte Pflanzengen in einer zweiten Klonierungsstelle desselben Vektors ebenfalls kloniert. Der erzeugte Zwischenvektor wird nach der Isolation aus E. coli in Agrobacterium-Zellen eingebracht. Es kommt zur Rekombination der homologen Bereiche des Zwischenvektors und dem Ti-Plasmid des Bakteriums. Infiziert man nun eine Pflanzenzelle mit diesen Agrobacterium-Zellen, wird das rekombinierte Ti-Plasmid in die Pflanzenzelle übertragen. Das eingebrachte Plasmid bezeichnet man als integratives Plasmid.Bei dem integrativen Plasmid werden die Gene für die Auxin- und Cytokinin-Synthese entfernt, um eine Tumorbildung bei der transformierten Pflanze zu verhindern. Ebenso verfährt man mit dem Gen für die Opin-Synthese, damit der Stoffwechsel der Pflanze nicht überflüssig belastet wird. Hingegen wird ein Gen, das Resistenz beispielsweise gegen das Aminoglycosid-Antibiotikum Kanamycin verleiht, als selektiver Marker in das integrative Plasmid eingebaut.
• „binärer“ T-DNA Vektor • ori für Replikation in A. tumefaciens und E.coli• konjugativer Transfer möglich
• Transgene Pflanzen in der Forschung: Überexpression eines (neuen) ZielgenesInaktivierung eines vorhandenen GenesStudium der Genexpression mit Indikatorgenen…
• Agrobacterium tumefaciens - Stamm mit „entschärftem“ Ti-Plasmid keine T-DNA Region mehrkein Opin-Katabolismus mehraber noch vir-Funktionen, die in trans wirken
• Ein binärer Vektor zur Pflanzentransformation mit dem Indikatorgen GUS: pBI121 • Durch Fusionierung einer Proteinsequenzan den Aminoterminus von GUS kann dasIndikatorprotein in ein Zellkompartimentdirigiert werden. Solche Translationsfusionenbeeinträchtigen die Indikatorgenaktivität nicht.• Durch Austausch des CaMV 35S Promotorsgegen eine andere, noch nicht charakterisiertePromotorsequenz kann die Promotoraktivitätin unterschiedlichen Geweben undEntwicklungsstadien verfolgt werden.
• NOS Nopalinsynthetase
• NPT: Neomycinphosphotransferase
• CaMV: Cauliflower Mosaic Virus
• GUS: ß-Glucuronidase
• Chemie der Pflanzenzelle H2O, CO2 - H,O,C - Wasser, Kohlendioxid, KohlenwasserstoffeCarbonsäuren, Alkohole,Kohlenhydrate („Zucker“), einige LipideNO3- (NH4+) - N - AminosäurenH2PO4 - P - Nukleotide, PhospholipideSO42- - S - 2 Aminosäuren, Sulfolipide, Coenzym AMg2+ - Mg - Chlorophyll, Kofaktor vieler EnzymeCa2+ - Ca - Membranstabilität, SignaltransduktionK+ - K - Osmotikum, Osmoregulation, CofaktorFe3+ > Fe2+ - Fe - Häm, Ferredoxin, Cytochrome, Katalase, PeroxidaseZn2+ - Zn - Alkoholdehydrogenase, Carboanhydrase et c.Cu2+ - Cu - Plastocyanin, Phenolase, Laccase, CytochromoxidaseMn2+ - Mn - PS2, Superoxiddismutase, CitratcyclusenzymeCl- - Cl - OsmoregulationMo7O246- - Mo - Nitratreduktase, Sulfitoxidase et c.B(OH)3 - B - Zellwandaufbau
• Primärstoffwechsel • Der Primärstoffwechsel istverschiedensten Organismengruppengemein. Er umfasst denMetabolismus von– Aminosäuren– Nukleotiden– Kohlenhydraten– Lipiden• Insbesondere der Anabolismusist bei autotrophen Organismenbiochemisch viel reicher als beiheterotrophen.• Für letztere sind mancheSubstanzen essentielleNahrungskomponenten.Sie sind auf die Syntheseleistungder Pflanzen angewiesen.
• Sekundärstoffwechsel • Der Sekundärstoffwechselist spezifisch für Organismengruppen(bzw. deren Ordnungen,Familien oder einzelnen Arten)• Er ist nicht zwingend für dieeinzelne Zelle überlebensnotwendig,hat aber oft ökologischeFunktion für den Organismus,z.B. in Pathogenabwehr oderSamen- oder Pollenverbreitung.• Er zweigt biochemisch vomPrimärstoffwechsel ab.• Man findet ihn in Pilzen undPflanzen, hier v. a. in denAngiospermen. WichtigeSekundärmetabolite sind z.B.– Alkaloide– Isoprenoide (Terpenoide)– Phenylpropanoide („Phenole“)
• Die Photosynthese • ist der lebensspendende Prozess auf der Erde schlechthin.Kohlendioxid der Luft wird in reduzierte organische Verbindungen(primär Glucose) assimiliert, die allen Lebensformen alsErnährungsgrundlage zur Verfügung steht.• produziert jährlich 2 x 1011 Tonnen reduzierten Kohlenstoffs aufder Erde.• ist außerdem neben der Reduktion von Kohlenstoff auch an derReduktion von Stickstoff & Schwefel, aufgenommen als Nitrat undSulfat, beteiligt.• der Pflanzen und Grünalgen geht auf die endosymbiontischeAufnahme eines cyanobakteriellen Vorläufers zurück, der zumChloroplasten evolvierte. Sie ist also keine Erfindung derBotanik, sondern existiert, teils in sehr einfacher Form, auch inProkaryonten, z.B. im halophilen Archaebakterium Halobacteriumhalobium.• hat dann stets die prinzipielle Gemeinsamkeit, dass in einerprimären Reaktion über einer Membran ein Protonengradiententsteht, der der ATP-Synthese dient.

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