Pflanzenphysiologie (Subject) / Pflanzenphys (Lesson)

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• Auf welchen Ebenen kann Genexpression kontrolliert werden? 1.Chromatin remodelling 2.Transkription 3.mRNA processing 4.mRNA Transport 5.mRNA Stabilität 6.Translationale Kontrolle 7.Protein Stabilität
• Epigenetik (Über-Genetik): stabil vererbbare veränderte Genexpressionsmuster, die ohne Veränderung der DNA-Sequenz erfolgen [epigenetisch erst dann wenn es vererbbar/stabil ist]
• Epigenetische Modifikationen -Methylierung von DNA -Histon-Modifikation -Einbau von Histon-Varianten
• drei Arten von DNA-Methyltransferasen in Arabidopsis -MET1(Methyltransferase1): 5’-CG-3‘; Silencing von Transposons, repetitive Elementen, imprinted genes -CMT3(Chromomethylase3): 5’-CHG-3’ [H=A, C oder T], interagiert mit Histon-Markierungen -DRM1, DRM2(Domains rearranged 1 und 2): 5’-CHH-3’, vor allem für repetitive Elemente, benötigt targeting durch siRNAs
• Histone können modifiziert sein durch: -Acetylierung (Ac) -Ubiquitinierung (Ub) -Methylierung (Me) -Phosphorylierung -Sumoylierung (Su)
• H3K4me H3K9me H3K27me3 H3K4me: ist assoziiert mit aktiv transkribierten Genen und mRNA -H3K9me: assoziiert mit methylierter DNA (Me-C) und Transposons -H3K27me3: ist mit Genen und Transposons assoziiert ;die Methylierung ist in Pflanzen sehr wichtig - kann direkt bewirken, das ein Gen ausgeschaltet wird; erfolgt durch einen hoch-konservierten Proteinkomplex: Polycomb Repressive Complex2 (PRC2)
• Varianten für Histon H3 CENH3, H3.1, H3.3 CENH3 ist in Nucleosomen am Centromer eingebaut und wichtig für die Stabilität der Centromere -H3.1 und H3.3 unterscheiden sich nur in vier Aminosäuren, sind sehr unterschiedlich verteilt: H3.1 im Heterochromatin, H3.3 ist an aktiv exprimierten Genen
• Varianten für Histon H2 H2AX, H2AW, H2AZ H2A.W: ist mit Heterochromatin assoziiert und verstärkt die Packung des Heterochromatins (spezifisch in Pflanzen) H2A.Z: moduliert die Position der Nucleosomen und kann transkriptionell aktivierend und reprimierend wirken; hoch konserviert und in vielen Organismen essentiell; in Hefe wird H2A.Z mit H2A ausgetauscht durch den konservierten, ATP abhängigen chromatin remodelling complex SWR1; H2A.X:assoziiert mit Doppelstrang-Brüchen und ist wichtig für DNA-Reparatur-Mechanismen
• Signale, die den Blühzeitpunkt regulieren -CO(CONSTANS) wird nur unter Langtagbedingungen in Blättern stabil exprimiert à aktiviert die Expression von FT=Flowering Locus T à FT wird über das Phloem in das Spross-Apikalmeristem transportiert -FT aktiviert im Meristem die Expression von Genen für die Ausbildung der Blüte -FLC verhindert den Übergang zur Blüte, FLC Mutanten blühen ohne Vernalisation; reduziert die Expression von FC=transkriptioneller Repressor -FLC wird während Vernalisation immer stärker gesilenced -welche Faktoren regulieren die Expression von FLC? àVIN3 Expression während Vernalisation hoch exprimiert                                                                                                                                (interagiert mit PRC2 Komplex) àLike Heterochromatin Protein1 (LHP1) ist ein Teil des                                                                                             PRC1-like Komplexes à Expression von FLC bleibt nach Winter weiter stabil reprimiert; silencing ist in lhp1 Mutanten nicht stabil und steigt bei warmen Temperaturen direkt wieder an; LHP1 ist nicht für die Einleitung ab die Erhaltung des Silencing notwendig!! àRegulation des FLC durch Chromatinmodifikationen; viele Stressgene werden epigenetisch reguliert
• Erhaltung von Chromatinmodifikationen nach DNA-Replikation und Zellteilung -Transport von neu synthetisierten Histonen in den Kern durch Histon-Chaperon-Komplexe ASF1 (AntiSilencingFactor) und CAF1 (ChromatinAssemblyFactor1) -Recycling der Histone (+Modifikationen): Histon-Komplexe werden vor der DNA-Pol in die neu synthetisierten Stränge eingebaut zusammen mit neu produzierten Histon-Oktameren
• Kymograph dynamisches Mikrotubuli Assay, Darstellung über Raum und Zeit
• Proteine, die die Depolymerisation begünstigen -Katanin: lagert an Tubulin (Ausläufern, die ins Cytoplasma ragen), schnappt sich Ausläufer und zieht dran und löst es raus --> Loch im Mikrotubuli -Kinesin13: depolymerisiert vom Ende her (abnagen), landet auf Mikrotubuli, diffundiert hin und her; am Ende bindet es an Dimer, hält es fest und reißt es ab
• Proteine, die die Depolymerisation verhindern -MAP65-4: Mikrotubuli assoziierte Proteine, hält Mikrotubuli auf Abstand; durch diese Quervernetzung: Stabilisierung durch Nachbarn -Tau [in Tieren] (auch MAP): höhere Wachstumsrate, stabilisiert Polymerisation, mobiles Protein -Paclitaxel/Taxol (Gift aus Eibe) stabilisiert ebenfalls Mikrotubuli (bindet an MT und verhindert Dynamik --> daher giftig)
• Mikrotubuli destabilisierende Wirkstoffe -Oryzalin, Vinchristin, Colchicin -entziehen der Lösung Tubulin à Polymerisation verlangsamt à Depolymerisation höher
• Cytochalasin B verringert die Strömungsgeschwindigkeit, indem es an Aktin bindet und die Polymerisation verhindert  Cytoplasmaströmung ist abhängig von Aktin und Myosin
• Gelsolin verflüssigt Aktingele
• Regulation der Aktin-Polymerisation  -Cofilin löst UE heraus -Profilin bindet an freies Aktin (mit Profilin keine Polymerisation) -an Thymosin β4 gebunden: kann nicht mehr direkt zur Polymerisation genutzt werden à Speicher für später -Fimbrin: bündelt Aktinfilamente à Stabilität -Arp2/3 formt Aktinfilamentverzweigungen -Phalloidin (Gift vom grünen Knollenblätterpilz) stabilisiert Aktinfilamente und verhindert Depolymerisation (Aktin überall) -Latrunculin A (rote Koralle) verhindert Aktinpolymerisation
• Nexin bildet Querbrücken zwischen den Mikrotubuli
• MISK prozessives minusendgerichtetes Kinesin; diffundiert entlang der MT Achse, verschiebt antiparallele MTs gegeneinander
• OsKCH1 ist ein minusendgerichtetes Kinesin14, transportiert Aktinfilamente entlang der MT:
• Physiologische Funktionen von Ionenkanälen -Osmoregulation (z.B. Schließzellöffnung): K+ ist ein Hauptosmotikum; wenn es in Zelle akkumuliert, fließt Wasser nach und der Turgordruck steigt und öffnet die Stomata -Kontrolle des Membrampotentials -Signalgebung (z.B. Ca2+ Ionen) -Aufnahme und Verteilung von Ionen
• Selektivitätsfilter lässt nur K+ Ionen durch in Porenregion mit Signatursequenz Thr-Val-Gly-Tyr-Gly
• GUS Färbung -das Enzym β-Glucuronidase hydrolysiert X-Gluc zu Glucuronsäure und 5-Brom-4-chlor-indoxyl; letzteres wird vom Sauerstoff der Luft zum tiefblauen Farbstoff 5,5’Dibrom-4,4-dichlor-indigo oxidiert -Gus als Reportergen kann bei Pflanzen Transformationen genutzt werden, um die Transformationseffizienz zu testen -durch die Kombination des β-Glucuronidase-Gens mit dem Promotor eines beliebigen Gens kann dessen Expresion gewebespezifisch untersucht werden Blaufärbung=Promotor aktiv
• Northern Blot Vergleich der Menge einer spezifischen RNA in verschiedenen Proben -Gel (Auftrennung von RNA der Größe nach) -aufgetrennte RNA wird auf Membran transferiert; ribosomalee 25sRNA als Kontrolle -Inkubation der Membran mit einer radioaktiv, chemisch oder fluoreszierend markierten, der gesuchten DNA-Sequenz komplementären RNA (=Sonde) -Entstehung von Basenpaarungen der Sonde mit der gesuchten DNA-Sequenz, die sich durch die Markierung identifizieren lässt (vorher die nicht gebundenen Sonden abwaschen) -heutzutage werden eher Microarrays oder qPCR verwendet -Southern Blot: gleiches Prinzip nur mit DNA; ermöglicht die Identifikation einer DNA-Sequenz innerhalb der Erbsubstanz
• Western Blot -Proteine, die in einem Gel (SDS-Gel) aufgetrennt wurden, werden auf eine Membran übertragen; dort werden einzelne Proteine spezifisch durch Antikörper identifiziert -nach dem Blotten wird die Membran mit entsprechenden Antiseren inkubiert und die Immunseren detektieren das Protein; gebundene Antikörper werden durch einen speziespezifischen 2. Antikörper, der ebenfalls mit Peroxidase markiert worden ist, detektiert -Sichtbarmachung des Substratumsatzes durch Chemilumineszens: die dabei freigesetzten Lichtmengen führen auf einem Röntgenfilm nach dessen Entwicklung an den Stellen zur Schwarzfärbung, an denen Peroxidase-markierte Antikörper gebunden haben; in einem Gel werden so die aufgetrennten Proteine in Form von Banden sichtbar
• Möglichkeiten Gen auszuschalten: -Knockout über Agrobakterien -RNAi: RNA-Interferenz -CrisprCas-Mutagenisieren (bestrahlen oder chemisch; EMS Ethylmethansulfat à Punktmutationen)
• RNAi -RNA Interferenz: Zellmechanismus, der die Expression von Genen in einer Zelle beeinflusst; findet zwischen Transkription und Translation statt -die RNA Interferenz wird durch kleine, doppelsträngige RNA-Moleküle (siRNA-small interfering RNA) ausgelöst -Angriffspunkt der RNA Interferenz ist die mRNA; taucht siRNA in der Zelle auf, reagiert die Zelle, in dem sie die gesamte mRNA zerstört, die dieselbe Nukleotid-Sequenz wie die siRNA besitzt, dadurch werden die von dieser mRNA codierten Proteine nicht mehr produziert (ursprünglich wahrscheinlich Schutzmechanismus der Zelle gegen „zellfremde“ RNA z.B. Virus-RNA)
• Bimolecular Fluoreszence Complementation (BiFC) -Protein-Protein Interaktion in Zelle nachweisbar -basiert auf der Komplementation zweier nicht fluoreszierender Fragmente eines fluoreszierenden Proteins; durch Zusammenlagerung der beiden Fragmente wird ein intakter, fluoreszierender Komplex erzeugt -AKT1 an N-terminales Fragment und CIPK3 an C-terminales Fragment gebunden; [als Kontrolle AKT1 an N, leerer Vektor an C] -treten beide Fragmente als Folge einer Interaktion der zu untersuchenden Proteine, kann eine Zusammenlagerung und Komplementation zu einem intakten Gesamtprotein erfolgen, welches fluoresziert à hier gelb an Plasmamembran àVerfahren um die Interaktion und Lokalisation zu prüfen
• Yeast two Hybrid (YTH) -Voraussetzung ist ein Transkriptionsfaktor (TF;oft GAL4) aus zwei getrennten Domänen: der DNA-Bindungsdomäne (BD) und der Aktivierungsdomäne (AD); werden diese beiden Domänen voneinander getrennt, kann nur bei enger räumlicher Assoziation ein funktionsfähiger Transkriptionsfaktor resultieren -zwei Plasmide werden verwendet: 1. Codiert für das Fusionsprotein aus dem zu untersuchenden Protein A und der AD von GAL4 und Plasmid 2 für das Fusionsprotein aus Protein B und BD von GAL4 -Plasmide werden in Hefezelle transformiert; Hefe ist Mangelmutante, die autotroph für Histidin ist; um zu gewährleiten, dass ein Hefeklon tatsächlich beide Plasmide aufgenommen hat, besitzen die Vektoren Selektionsmarker (in diesem Fall Gene, welche für die Synthese von Histidin essentiell sind); wenn Hefen auf Medium ohne Histidin kultiviert werden, können somit nur doppelt transformierte Hefeklone überleben -Promotor ist jeweils zwei bestimmten Reportergenen vorgeschaltet: dem lacZ-Gen aus E.coli und einem Wachstumsgen, das eine Stoffwechselmutation komplementieren kann (können auch auf Minimalmedium wachsen) -statt des bekannten Proteins B kann man an die AD auch eine cDNA Bank fusionieren um unbekannte Interaktionspartner zu finden -interagiert mit denen auf den es wächst
• Regulation des AKT1 Proteins 1.Promotoraktivität(nachweisbar durch GUS): Was beeinflusst Promotoraktivität?                 -Transkriptionsfaktoren (cis-,trans-Elemente)                 -Polymerase                 -Histone (wenn dicht gepackt, kann Transkriptionsfaktor nicht binden)                 -entweder man aktiviert oder reprimiert den Promotor (Repressor auflösen) 2.Transkriptlevel (mRNA): mRNA wird modifiziert                 -splicing, 5’Tailing, 3’Caping                 -Proteine binden an bestimmte mRNA à wird nicht translatiertà erst bei Singal liegt mRNA frei und      kann translatiert werden                 -wirken nicht nur dort wo sie transkribiert wurden, werden auch transportiert 3.Proteinmenge                 -wenn Transkriptlevel hoch, heißt das nicht automatisch Proteinlevel hoch                 -vllt auch von RNAbindenden Proteinen gebunden und woanders hintransportiert                 àman muss alle Ebenen betrachten 4.Proteinaktivität                 -posttranslationale Modifikationen
• Stomabewegung -Einstrom von K+ und Cl- à Wasser Nachstrom à Turgordruck steigt àÖffnung -Ionenausstrom, ABA (Absidinsäure), Dunkelheit à Schließung -Ioneneinstrom, pH Ansäuerung, Licht à Öffnung GORK: Gen, dass für Kaliumkanal kodiert; Mutante nur Kaliumeinstrom
• Auswirkungen versalzter Böden A)in der Pflanze: verzögerte/verminderte Keimung, reduziertes Wachstum, Blattschäden B)im Boden: Bildung von Salzkrusten, Wasserrückstau (Waterlogging) Schädigung bei à Nichthalophyten (Glykophyten) Anpassung bei à Halophyten (salztolerante Pflanzen) à vor allem in Salzwiesen und Mangroven Obligate Halophyten: Queller, Salzbusch Fakultative Halophyten: Plantago maritima, Zuckerrübe Standortindifferente Halophyten: Pontentilla anserina, Gerste, Tomate Glykophyten: Avocado, Zitrone, Reis, Arabidopsis thaliana
• Auswirkungen von Salzstress A)im Boden 1.Osmotische Effekte à erschwerte Wasseraufnahme (Wasserpotential außen sinkt; Wasser immer von positiv nach negativem Potential) 2.Natriumàverminderte Aufnahme von Kalium, Calcium und Stickstoff àv.a. Natrium-induzierter Kaliummangel (Na+ gelangt in Zellen in wässriger Lösung; bilden Hydrathüllen; für andere reicht das Wasser nicht; hohe Natriumkonzentration: sehr toxisch für Proteine – Faltungen werden beeinflusst) B)in der Pflanze 1.Salz-Toxizität: Hemmung des Proteinstoffwechsels, Erhöhung der Aktivität des Pentosephosphat-Zyklus und eine Verminderung der Glykolyse -Natrium und Chlorid in höherer Konzentration sind toxisch für viele Stoffwechselprozesse
• Chaotrope Salze lösen die geordneten Wasserstoffbrückenbindungen auf; stören die Wasserstruktur; wirken denaturierend auf Proteine
• Osmotischer Stress -Pflanzen bekommen Probleme mit der Wasseraufnahme àähnlicher Effekt wie Trockenstress à Salz erhöht das osmotische Potential (erniedrigt das Wasserpotential) im Boden und im Apoplasten -Turgordruck wichtig für Wachstum (Zellvergrößerung,Elongation), Gasaustausch (Stomabewegung), Phloemtransport, Transportprozesse an Membranen, Festigkeit/mech. Stabilität, Bewegungen (Nastien der Mimosen), Sekretabsonderung von Drüsengeweben, Samenverbreitung (Springkräuter) -in sehr trockenen Böden kann das Wasserpotential unter den permanenten Welkepunkt fallen (welk=Turgordruck ist nicht mehr so wie er sein sollte; Wasser muss osmotischen Wert in Zellen erhöhen um Wasserpotential in Pflanze zu erhöhen à Wasser kann wieder aufgenommen werden)
• Anpassung des Wasserpotentials Vakuole: Akkumulation von Ionen (K+,Na+,Cl-,Malat) Cytosol: Akkumulation von kompatiblen Soluten: Aminosäuren, Zucker, Zuckeralkohole, quaternäre Ammoniumverbindungen
• Kompatible Solute im Cytosol -Vermeidung der Na+ Toxizität -Anpassung des Wasserpotentials -Kompatible Solute sind organische Verbindungen mit geringer molarer Masse -bei physiologischem pH-Wert elektrisch neutral (polar, dipolar/zwitterionisch) -stark hydrophil -dringen nicht in Hydrathülle von Makromolekülen ein -interferieren nicht  mit Metabolismus -wirken z.T. als Antioxidantien (z.B. myo-Inosit, Mannit, Prolin)
• ABA Produktion Die pflanzliche Biosynthese findet vor allem in Blättern als allgemeine Stressantwort (vor allem bei Trockenstress) statt. Als Signal zur Synthese dient meist ein Abfall des zellulären Turgors.
• Synthese von Prolin -in Arabidopsis : Synthetase wird durch Salzstress und ABA induziert: mehr Prolin; Prolin Dehydrogenase wird invers reguliert -verminderte Expression der Prolin Dehydrogenase àerhöhte Salztoleranz Die Aminosäure schützt die Pflanzenzellen vor schädlichen reaktiven Sauerstoffradikalen, die bei Trockenstress in den Chloroplasten frei werden. Diese entstehen vermehrt, da Pflanzen bei längeren Trockenperioden ihr Wachstum und die Photosynthese drosseln. Während der CO2-Reduktion in den Chloroplasten entsteht normalerweise der Elektronenakzeptor NADP . Sinkt die NADP -Konzentration, so werden Elektronen stattdessen von Wasser aufgefangen. Es entstehen reaktive Sauerstoffradikale, die die Enzyme in der Zelle schädigen. Prolin schützt die Pflanzenzellen, indem es die Umsetzung von NADPH in NADP ankurbelt. Zudem sichert Prolin das Überleben der Pflanze als sogenannter Osmoregulator. Es wirkt als Puffer gegen Salze, die sich bei Trockenheit und Salzstress in den Vakuolen anreichern. Normalerweise würde die Vakuole dem umliegenden Cytoplasma und den Chloroplasten aufgrund des osmotischen Potentials das Wasser entziehen. Mit dem Trick, Prolin im Cytoplasma anzureichern, gleicht die Pflanzen den Konzentrationsunterschied wieder aus.

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