'Vokabeln'

Question 1

mRNA Export

Accepted Answer

Transkription und Reifung von mRNAs erfolgt im Zellkern → Export durch Kernporen (Interaktion mit Nuclear Transport Receptor)

Question 2

zentrales Dogma der MoBi

Accepted Answer

Sobald (sequenzielle) Information einmal in ein Protein übersetzt wurde, kann sie dort nicht wieder herausgelangen

Question 3

Ribosom

Accepted Answer

"Proteinfabrik"; Ribonucleinsäurekomplex aus 60% rRNA (5s, 5.8s, 18s und 28s werden im Nukleulus modifiziert und prozessiert → "Reifung") und 40% Proteine; 70s bei Prok. und 80s bei Euk. (Bildung im Nukleulus); bestehen jeweils aus großer (50s/60s) und kleiner (30s/40s) ribosomaler Untereinheit; binden mit Hilfe von Proteinen (Initiations-, Elongations- und Release-Faktoren) an die mRNA und sorgen für Interaktion zw. mRNA und tRNA → A-Site, P-Site, E-Site; Polyribosom: Ribosom ist direkt mit einer mRNA assoziiert Antibiotika: meist von Pilzen produzierte Substanzen („Wettbewerbsvorteil“). Viele Antibiotika binden die an konservierte Strukturen der Ribosome → interferieren mit effizienter Proteinbiosynthese → bakterielle Resistenzmechanismen - „biologisches Wettrüsten“

Question 4

tRNA

Accepted Answer

„Übersetzen“ genetischen Code in Aminosäuren; hochkonservierte „Kleeblattstruktur“; zusätzliche H-Brücken etablieren L-shaped 3- dimensionale Struktur mit: Acceptor stem: bindet AS durch Aminoacyl-tRNA-Synthasen unter Verbrauch vo ATP; pro tRNA bestimmte AS: Aminosäuren „passen“ in sog. „active-site pockets“ der Aminoacyl-tRNA Synthetase T-loop Anticodon-loop: interagiert mit Codons (3-Basen-Code) der mRNA; „Wobble“: Zwischen letztem Nukleotid im Codon und erstem Nukleotid im Anticodon kann es auch zu „Nicht- Watson-Crick“-Paarungen kommen D-loop

Question 5

Proteine

Accepted Answer

Primärstruktur: lineare Ketten aus L-Aminosäuren - über Peptidbindungen verknüpft: N-(Amino)-Terminus bindet durch Kondensationsreaktion an C-(Carboxy)- Terminus müssen dann "reifen" bevor sie funktionstüchtig sind: Sekundärstruktur: Wasserstoffbrücken zwischen N-H und C=O Gruppen definieren Faltung von Proteinen in wässriger Lösung (Konformation) α-helix: striktes spacing der H-Bücken 3.6 Aminosäuren pro Windung β-sheet: parallele und antiparallele Anordnung mehrer Sekundärstrukturen bilden Tertiärstruktur durch self assembly (nicht- und kobalente Bindungen) ; unter schlechten Bedingungen (z.B. Hitze) nur mit Hilfe eines Chaperone Proteins (Hsp 60 und 70) assoziation von mehreren Proteinkomplexen zu 3-dimensionale Anordnung ist die Quartär-Struktur: mit homomeren (identische Untereinheiten) und heteromeren (unterschiedliche Untereinheiten) Komplexen ⇒Degradation: ATP-abhängige Protease-Aktivität; entstehende Substrate werden im Inneren des Proteasomes vollständig zu kleinen Peptiden hydrolisiert

Question 6

Aminosäuren

Accepted Answer

organischer Verbindungen mit mindestens einer Carboxygruppe (–COOH) und einer Aminogruppe (–NH2) oder substituierten Aminogruppe (–NR2) → „Zwitterion“ bei neutralem pH; in Proteinen als L-Enantiomere

Question 7

Translation - Genetischer Code

Accepted Answer

Nirenberg und Matthaei Experiment (1961): mRNA Fragmente mit definierter Sequenz zb. UUU-Codon → Zugabe von Ribosomen, tRNAs und Faktorenzymen → Fütterung mit Aminosäuremixes (jeweils eine markiert) → Inkubation → Filtration die ungebundene AS durchlässt und polymerisierte zurückhält → wenn Radioaktivität im Filter: codiert UUU-Codon für makierte AS weiterführende Experimente führten zur Charakterisierung aller 64 möglichen Triplet-Codes - vollständige Entschlüsselung des genetischen Codes: Triplet-Codons: Jedes Codon spezifiziert eine Aminosäure Codons überlappen nicht drei Stop-Codons UAA, UGA, UAG und ein übliches Start-Codon AUG Code ist degeneriert: Aminosäuren werden durch 1 bis 6 unterschiedliche Codons repräsentiert mRNAs werden in 5‘-3‘ Richtung translatiert

Question 8

Translation - Ablauf

Accepted Answer

erfolgt im Ribosom und ist in drei Stufen geteilt: Initiation: AUG fungiert als Startcodon - Initiator tRNA bildet mit small subunit und Initiationsfaktoren einen Komplex und scannt mRNA (5‘-3‘ Richtung) nach AUG (Consensus-Sequenz 5‘- ACCAUGG-3‘ bzw bei Prok.: 5‘-AGGAGG-3‘ upstream von Start- AUG" ) → dissoziation von Initiationsfaktoren und bindung der large subunit → Bindungsstellen im Ribosom: A-(Aminoacyl), P-(Peptidyl) und E-(Exit)-sites für Interaktion mit tRNAs → P und A site so angeordnet, dass darin positionierte tRNAs mit 2 unmittelbar benachbarten Codons auf mRNA interagieren - minimiert frameshifting. Elongation: durch Polypeptidbindungen der AS am Ribosom; geladene tRNA dockt bei A-site an; Codon-Anticodon paarung Polypeptid an tRNA an P- site wird auf aminoacyl tRNA an A-site übertragen (katalysiert durch Peptidyl Transferase) - Peptid um eine Aminosäure verlängert grosse Untereinheit wandert Richtung 3‘ der mRNA kleine Untereinheit wandert Richtung 3‘ der mRNA - entladene tRNA an E-site wird freigesetzt, A- site kann neue geladene tRNA aufnehmen ￼￼￼Termination: Stopcodons fungieren als universelle Signale; Release Factors binden Ribosom mit Stopcodon in A-site → Somit kein docking einer beladenen tRNA möglich→ Polypeptid nicht mehr an tRNA gebunden - wird freigesetzt → Proteinbiosynthese terminiert

Question 9

Translational Frameshifting

Accepted Answer

In Ausnahmenfällen in Eukaryoten: Erlaubt Synthese von unterschiedlichen Proteinen von einer mRNA → Analogie zu polycistronischen mRNAs in Prokaryonten; RNA-Sekundärstruktur führt zu -1 frameshift (Leserasterverschiebung) → erlaubt Ablesen des längeren Leserahmens (10%)

Question 10

Genexpression

Accepted Answer

Unterschiedlichste Zellen eines Organismus differenzieren in Vielzahl an spezialisierten Geweben/Organen. Im Normalfall keine Modifikationen auf Genomebene sondern Ermöglicht durch Variabilität in der Genaktivität

Question 11

Regulation der Transkription

Accepted Answer

spezifische Bindung an DNA - Aktivierung oder Repression der Gentranskription → Interaktion über Bindung an Erkennungssequenzen im Bereich der regulierten Gene: oftmals konservierte cis- acting Elemente. ABER: Basen im Inneren der Doppelhelix angeordnet Wie werden DNA Motive erkannt? Nukleotide in Doppelhelix produzieren DNA- sequenzspezifische Information die auch bei geschlossener doppelhelicaler Struktur von Proteinen erkannt wird (z.B. Wasserstoffbrückendonor/ akkzeptor, ...) → Unterschiedliche DNA- Motive definieren Spezifität der DNA-Protein Interaktion (Signatur der Genregulation). DNA-Bindungsdomäne beeinflussen Transkriptionsfaktoren: Helix-Turn-Helix (HTH): Prok. und Euk. Zinc Finger: Prok. und Euk. Leucine Zipper: Prok. und Euk. Transaktivierungsdomäne: Tryptophan Repressor: E.coli Lac-Operon: E.coli; Kombination von Repressor und Aktivator Kontrolle; Lac Operon kodiert Gene für Lactose Verwertung - wird aktiviert wenn Glukosekonzentrationen sinken und Lactose Konzentration hoch ist (sonst wird Pol von Repressor gestoppt) → Lac Operon Expression DNA-Rearrangements: Prok. Hierachische Kontrolle: Prok. DNA-Looping: Prok. und Euk.

Question 12

Regulation der Transkription in Eukaryonten

Accepted Answer

wesentliche Unterschiede: 5 ver. Transcription Factors mit 27 Subunits (→ Vielzahl an regulatorischen Möglichkeiten!); Mediatorkomplex [=Schnittstelle der Interaktion zwischen generellen Transkriptionskomponenten (RNA-Pol, ...) und genspezifischen Regulatoren]. Beispiele: Transkriptions Aktivator Proteine Chromatin Remodelling Aktive Repression micro RNAs RNA Interferenz (RNAi) DNA-Methylierung

Question 13

Genomic Imprinting

Accepted Answer

Nicht mendelnder Vererbungsgang in diploiden Organismen; Von einigen Genen wird entweder das mütterliche oder das väterliche Allel exprimiert - jeweils andere Kopie durch Gene Silencing (DNA-Methylierung, etc.) stillgelegt → „Imprint“ wird in den Keimbahnzellen entfernt Relevanz: Genetische Konflikt-Hypothese: Divergierende „väterliche und mütterliche Interessen“ die Nachkommenschaft betreffend werden epigenetisch determiniert

Question 14

Regulation der Regulatoren

Accepted Answer

Metaregulation: Protein Synthese, Ligand Binding; Covalent Modification; Addition Of Second Subunit; Unmasking; Stimulation Of Nuclear Entery; Release From Membrane Etablierung eines Expressionsstatus: „Cell Memory“: transistant Signal aktiviert Expression von best. Protein - merkt sich AKtivität über Generationen „feedback“ und „feedforward“ Mechanismen: essentiell für robuste Expressionskontrolle Etablierung von selbststabilisierenden Mechanismen wie z.B. Oszillierende Expression von Genen

Question 15

Biotechnologie

Accepted Answer

(M)O's werden genutzt ein best. Produkt zu synthetisieren → Stammverbesserung: Selektion, Screening, mutagene Behandlung (chem., Strahlung,...) →Synthese meist durch Fermentation (=enzymatische Umwandlung organischer Stoffe in Säure, Gase oder Alkohol)

Question 16

Gentechnik

Accepted Answer

Veränderung einer isolierten DNA → wird in Zelle eingebracht → neue Eigenschaften über Artgrenzen hinweg möglich (z.B. menschliche DNA in Bakterien für Insulin) ⇒meist Kombination mit Biotechnologie

Question 17

Klonierung

Accepted Answer

Einführung eines DNA-Fragments in einen Vektor, der die massenhafte Vermehrung dieser erlaubt (reine Form) → einzelne DNA Fragmente in reiner Form herstellen

Question 18

Klonierung Durchführung

Accepted Answer

Gewinnung der "Fremd"-DNA ("Insert") Auswahl eines geeigneten Vektors Präparation des Vektors (meist aus E. coli) Restriktionsverdau von Vektor und Insert (Restriktionsendonukleasen) Behandlung des Vektors mit Alkalischer Phosphatase [verhindert sofortige wiederverbindung der DNA-Fragmente durch austausch der Phosphat- mit OH-Gruppen (Hydrolyse)] Analyse der DNA mittels Agarose-Gelelektrophorese Ligation Transformation Selektion Screening

Question 19

Plasmide

Accepted Answer

kleine, in der Regel ringförmige, autonom replizierende, doppelsträngige DNA-Moleküle, die in Bakterien und in Archaeen vorkommen; extrachromosomal vorliegen; Nur auch in Eukaryoten; Größe 1 bis über 1000 kBp; Ein Plasmid nimmt i.d.R. nur 1 Insertmolekül auf; Eine Wirtszelle nimmt i.d.R. nur 1 Plasmid auf wichtige Bestandteile: Selektionsmarker: erlaubt das Selektieren von Bakterien welche das Plasmid tragen. Meist ein Gen das Antibiotikaresistenz vermittelt. Viele Plasmids tragen mehr als nur 1 Selektionsmarker. Replikationsursprung: ermöglicht die Replikation des Plasmids unabhängig von der genomischen DNA - ohne Replikationsursprung bleiben Sie über die Generationen nur erhalten, wenn sie in das Genom der Wirtszelle integriert werden Schnittstelle für ein Restriktionsenzym: die meisten gebräuchlichen Klonierungsvektoren verfügen über mehrere Schnittstellen, die man gemeinsam als „multiple cloning site" bezeichnet

Question 20

Einteilung von Plasmiden

Accepted Answer

Fertility (F-) plasmids: contain tra genes; capable of conjugation [= Teilen des Genoms von einer Spenderzelle (Donor) auf eine Empfängerzelle (Rezipient) durch direkten Zellkontakt] Resistance (R-) plasmids: can build a resistance against antibiotics or poisons and help bacteria produce pili; Historically known as R-factors Col-plasmids: contain genes that code for proteins that can kill other bacteria Degradative plasmids: enable the digestion of unusual substances Virulence plasmids: turn the bacterium into a pathogen

Question 21

Plasmidpräparation (DNA Reinigung: „Alkalische Lyse“ der Bakterien)

Accepted Answer

Wachstum der Bakterien (Übernacht-Kultur) und Ernte (Zentirfugation); Wichtig: Selektionsdruck aufrechterhalten → entsprechende Antibiotikum muss im Medium enthalten sein Re-Suspendierung: Das Bakterienpellet wird in einer Lösung, die Tris (Puffer), EDTA (cheliert divalenten Kationen → verhindert, dass die DNasen die Plasmid DNA zerstören), Glukose (für osmotischen Druck), divalente Kationen (Mg2+, Ca2+ → für Integrität der Zellwand) und RNase A (zerstört die freigesetzten RNA Moleküle nach der Lyse der Zellen enthält) resuspendiert. (alkalische) Lyse: enthält NaOH und SDS → Zerstörung der Zellwand (beide), Lösung der H-Brücken zwischen den Basen der DNA (NaOH → dsDNA zu 2 ssDNA), Denaturierung von Proteinen (SDS) Neutralisierung: Kaliumacetat neutralisiert die Lösung → H-Brücken können sich wieder ausbilden (dsDNA renaturiert) → selektiver Schritt: kleine Plasmidmolekülen gelingt die Renaturierung, die riesige gDNA schafft sie nicht → renaturierte Plasmid DNA bleibt in Lösung; gDNA fällt auf Grund hydrophober Wechselwirkungen mit den danturierten Proteinmolekülen aus und kann durch Zentrifugation abgetrennt werden Reinigung über Silica-hältige Säulen: durch chaotrope Salze wie z.B. Guanidiniumthiocyanat gehen die H-Brücken der DNA auf und die DNA kann in dieser Form an Silica binden → Waschen mit z.B. Ethanol → Puffer in die Säule für Trennung von Silica und Renaturierung der DNA → Trennung durch Zentrifugation ⇒ Einsatz in enzymatischen Reaktionen (Restriktionsverdau, Ligation, PCR, Sequenzierung, etc.)

Question 22

DNA-modifizierende Enzyme

Accepted Answer

5 große Klassen: DNA Polymerasen Restriktionsenzyme (meist Restriktionsendonukleasen) Modifikationsenzyme Ligasen Topoisomerasen

Question 23

Enzymatische Manipulation von DNA: Restriktionsendonukleasen

Accepted Answer

wurden entdeckt, als man untersuchte, wie sich Bakterien gegen Viren (Phagen) schützen: eindringende DNA der Viren wird durch die Restriktionsenzyme im Cytoplasma der Bakterien zerschnitten und damit inaktiviert. eigene DNA schützen die Bakterien durch Methylierung an entsprechenden Stellen → Modifikationsenzyme, die die DNA an denjenigen Stellen methylieren, an denen das eigene Restriktionsenzym die DNA schneiden würde; Allgemeine Arten: Typ II Restriktionsenzyme: Schneide- und Methylierungsaktivität auf getrennten Proteinen; binden an der Restriktionsstelle und schneiden auch dort (die meisten); benötigen kein ATP Typ I und III Restriktionsenzyme: ein und dasselbe Enzym methyliert und schneidet die DNA; binden an der Restriktionsstelle und schneiden woanders; benötigen ATP als Energiequelle Nutzung in der Gentechnik: DNA-Stücke gezielt an bestimmten Stellen spalten. Es gibt mehr als 4000 verwendete Restriktionsenzyme. Hier einige Beispiele: Hpa I: schneidet die 6 bp lange DNA-Sequenz in der Mitte glatt (blunt) durch Eco RI: schneidet eine 6 bp lange DNA-Sequenz überlappend durch, wobei klebrige Enden entstehen. Klebrig heißt hier, dass komplementäre Sequenzen mit dem herausragenden Ende hybridisieren können. Hier handelt es sich um 5‘ Überhänge. Hind III: wie Eco RI, nur bei aneren 6 bp Abfolgen (DNA-Sequenz) Pst I: schneidet ebenfalls überlappend. Es entstehen 3‘ Überhänge.

Question 24

Enzymatische Manipulation von DNA: DNA-Polymerasen

Accepted Answer

v.a. für PCR und DNA-Sequenzierung essentiell; polymerisieren nur in 5‘-3‘ Richtung (5‘-3‘ Polymerasefunktion) wobei das Nukleotid an das ein weiteres angefügt wird doppelsträngig vorliegen muss - d.h. es muß über H-Brücken an den Templatestrang gebunden sein; benötigt einen Primer - können aus RNA (Replikation) oder aus DNA (Gentechnik) bestehen; Beispiele für DNA Polymerasen die in der Gentechnik verwendet werden: beide von Bakterien aus Gysieren entnommen und in E.coli produziert → thermostabil bei 72°C Pfu-Polymerase (PCR): Exonuclease ist 3'-5' → proof-reading: wird falsche Base eingebaut, keine Basenpaarung mit dem Template Strang → Polymerase bleibt stehen → 3‘-5‘ Exonuklease spaltet falsch eingebaute Nukleotid ab → Polymerisation wird fortgesetzt; Enden sind blunt (glatt); v.a. für Klonierung Taq-Polymerase (PCR): Exonuclease ist 5'-3' (wie bei Okazaki-Fragmente) → kein proof-reading → relativ hohe Fehlerrate (Mutationen); Enden mit 3'A Überhang; knüpft ca. 1000 Nukleotide pro Minute; v.a. für Analyse/ Diagnose

Question 25

Klenow-Fragment

Accepted Answer

ist die größere der beiden Untereinheiten der DNA- Polymerase I von Escherichia coli; Es verfügt über neben der 5'-3'-Polymerase-Funktion auch über eine 3'-5'-Exonuclease-Aktivität, hat jedoch keine 5‘-3‘ Exonukleaseaktivität.

Question 26

klebrigen Enden/ sticky ends

Accepted Answer

Zwei DNA-Sequenzen werden beide z.B. mit Eco RI geschnitten, wodurch die gezeigten überhängenden Enden entstanden. Sie passen genau zueinander (selbe Nukletidabfolge wird geschnitten) und können über Wasserstoffbrücken den Zusammenhalt der beiden DNA Stränge unterstützen („Annealing“). Die Phosphodiesterbindung zwischen den benachbarten Nukleotiden jeweils eines DNA Stranges kann durch DNA Ligase geschlossen werden.

Question 27

Enzymatische Manipulation von DNA: Prokaryotische Methylasen

Accepted Answer

Methyltransferasen (Methylasen) erkennen spezifische DNA Sequenzen und übertragen eine Methylgruppe; Nutzung für Schutz der Bakterien vor ihren eigenen Restriktionsenzymen oder mismatch repair System; z.B. die dam und die dcm Methylase, sind in vielen Bakterienstämmen verbreitet und sind eigentlich beim mismatch repair (Reparatur von Fehlern nach der DNA Replikation) von Bedeutung. Trotzdem können sie beeinflussen, ob Restriktionsenzyme schneiden können oder nicht. nicht jede Methylierung muß die Aktivität eines bestimmten Restriktionsenzyms verhindern - sind relativ spezifisch (auf Basenabfolge bezogen!)

Question 28

Vektoren

Accepted Answer

sind die Träger der rekombinanten DNA; sie sind oft zur Einschleusung der DNA in die Zelle nötig; sowie zur stabilen Erhaltung der DNA im transformierten (Mikro)organismus; bringen meist nicht nur das Zielgen, sondern auch andere Funktionen in die Zelle ein: Selektionsmarker Replikationsursprung (Startpunkt der Replikation) Restriktionsstellen (meist in einer „Multiplecloningsite“) ev. auch Promotoren (bei Expressionsvektoren) wichtigsten Arten von Vektoren: Plasmide Viren, Phagen künstliche Chromosome

Question 29

Vektoren

Accepted Answer

sind die Träger der rekombinanten DNA; sie sind oft zur Einschleusung der DNA in die Zelle nötig; sowie zur stabilen Erhaltung der DNA im transformierten (Mikro)organismus; bringen meist nicht nur das Zielgen, sondern auch andere Funktionen in die Zelle ein: Selektionsmarker Replikationsursprung (Startpunkt der Replikation) Restriktionsstellen (meist in einer „Multiplecloningsite“) ev. auch Promotoren (bei Expressionsvektoren) wichtigsten Arten von Vektoren: Plasmide: "einfache" Klonierungsvektoren, Expressionsvektoren; Inserts in der Größe einige Kilobasen; Transformation Viren, Phagen: oft für das Anlegen großer Libraries verwendet; Transfer mittels Infektion (effizient); bis zu 23 Kilobasen können kloniert werden künstliche Chromosome: Klonieren von besonders großen Inserts, bis zu 300 Kilobasen

Question 30

Enzymatische Manipulation von DNA: Ligasen

Accepted Answer

für Reparatur von Einzelstrangbrüchen und Verknüpfen zweier Moleküle;DNA Ligase katalysiert die Verbindung eines DNA- Stranges mit einer freien 3‘-Hydroxylgruppe mit der freien 5‘-Phosphatgruppe eines anderen Stranges; Eukaryoten und Archea: ATP zu AMP und PPi gespalten; Bakterien: NAD+ zu AMP und NMN gespalten

Question 31

Enzymatische Manipulation von DNA: Ligasen

Accepted Answer

für Reparatur von Einzelstrangbrüchen und Verknüpfen zweier Moleküle;DNA Ligase katalysiert die Verbindung eines DNA- Stranges mit einer freien 3‘-Hydroxylgruppe mit der freien 5‘-Phosphatgruppe eines anderen Stranges; Eukaryoten und Archea: ATP zu AMP und PPi gespalten; Bakterien: NAD+ zu AMP und NMN gespalten: Ablauf: Bildung eines kovalenten Enzym-AMP Intermediats über eine Lysin-Seitenkette des Enzyms. Transfer der AMP-Gruppe auf das 5' Phosphat des DNA Strangs. 3‘-OH der DNA attackiert den AMP-DNA Komplex, wobei die Phosphoesterbindung geschlossen und AMP freigesetzt wird.

Question 32

Wie bringe ich die rekombinante DNA in die Zelle?

Accepted Answer

Transformation: Aufnahme freier DNA durch ein Bakterium und Änderung von Eigenschaften eines Organismus nach dem Einbau von Fremd-DNA v.a. durch: Elektroporation CaCl2 Transfektion: selbe wie Transformation nur bei höheren Organismen; v.a. durch: Gene Gun Mikroinjektion Elektroporation Infektion: der Befall eines Lebewesens durch Viren, Mikroorganismen (z.B. Bakterien) oder auch mehrzellige Organismen, der oft mit einer Übertragung genetischen Materials verbunden ist. Transduktion: Gentransfer, der dann auftritt, wenn Bakteriophagen Bruchstücke der Erbsubstanz ihrer Wirtszelle mitschleppen und so auf andere Bakterien übertragen.

Question 33

Agarose-Gel-Elektrophorese

Accepted Answer

DNA wandert zur Anode auf Grund der stark negativen Ladung der Phosphatgruppen;Siebeffekt des Gels lässt große Moleküle langsamer wandern als kleine Gelmaterial: Agarose oder Polyacrylamid (v.a. kleinere DNA Fragmente bzw. für DNA Sequenzierung!) Sichtbarmachen: Fluoreszenzfarbstoffe, die an die DNA binden und dort mit UV Licht zum fluoreszieren gebracht werden können. Klassisch: Ethidiumbromid; Modern: Sybrgreen, Sybrsafe, Midori Green - besser denn: Kein Durchtritt durch intakte Zellmembranen → Geringere Mutagenität, Erhöhte Sensitivität und Besser für die Umwelt Hybridisierung von Nukleinsäuren: Mit diesem Verfahren ist es möglich, spezifische Nukleinsäurefragmente in komplexen Gemischen zu detektieren. Typische Anwendungsbeispiele: Southern Blot: Detektion eines spezifischen Gens in genomischer DNA Northern Blot: Detektion einer spezifischen mRNA in gesamt-RNA

Question 34

PCR

Accepted Answer

Polymerase Chain Reaction erlaubt eine exponentielle Amplifikation (Vermehrung) der eingesetzten Template-DNA; Hauptanwendungsgebiete: Diagnostik (Nachweis von Krankheitserregern, Mutationen, Genexpression,...) und Gentechnik (Klonierung); Ablauf: Denaturierung der DNA (20 sec): Doppelstrang trennt sich, Wasserstoffbrücken gehen auf, einzelsträngige DNA (single-strand „ssDNA“) entsteht. 92°C reichen aus, höhere Temperaturen (95°C) v.a. bei langen, komplexen Templates. Annealing der Primer (20 sec): Wahl der Annealingtemperatur in Abhängigkeit von Länge und Zusammensetzung (GC Gehalt) der Primer Polymerisation (90 sec): 72°C ist die übliche Temperatur für Taq und Pfu Polymerase. Andere Polymerasen haben u.U. andere Temperaturoptima. Die Dauer der Polymerisationsphase hängt von der Länge des zu synthetisierenden PCR Produkts ab. Wiederholung er Schritte 1-3 für ca. 30 Zyklen! Filling in (5 min): Eventuell nicht vollständig fertiggestellte DNA Stränge werden bei 72°C komplettiert. Error prone PCR: Fehleranfälligkeit der Taq Polymerase kann auch bewußt zur Erzeugung von Zufallsmutationen in DNA eingesetzt werden und nicht optimale Reaktionsbedingungen gewählt werden → wichtige Methode im Proteinengineering z.B. Enzyme oder Antikörper optimieren

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