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Genetik (Subject) / Transkript Precessing (Lesson)

Transkription

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  • Das zentrale Dogma der Molekulargenetik Information fließt von DNA zu RNA zu Protein Gene (DNA) - Transcription -> Transcript (RNA) - Translation -> Polypeptide (amino acids) Gene (DNA) - Replication -> Gene (DNA) Gene (DNA) <- Reverse transcription - Transcript (RNA)
  • Transkription und RNA Prozessierung Replikation, Transkription und Translation findet in Bakterien gleichzeitig statt Replikation, Transkription und Translation finden in Eukaryoten in getrennten Kompartmenten statt (Nukleus und Zytoplasma) Fünf Klassen von RNAs sind essentiell für Genexpression:• mRNA• tRNA (Transfer RNA)• rRNA (Ribosomale RNA)• snRNA (Small Nuclear RNA)• miRNA (Micro RNA, non-coding RNA) Transkription und RNA Prozessierung wird durchProteinkomplexe und Ribonukleoproteinkomplexebewerkstelligt
  • RNA Polymerasen Pro- Eukaryoten In E.coli werden alle RNAs von einer einzigen RNA Polymerase abgeschrieben In Eukaryoten werden die einzelnen RNAs von drei unterschiedlichen RNA Polymerasen (>10 Untereinheiten) abgeschrieben RNA Polymerase - Nucleolus, Ribosomal RNAs, excluding 5S rRNA RNA Polymerase - Nucleus, Nuclear Pre-mRNAs RNA Polymerase - Nucleus, tRNAs, 5S rRNA, and other small nuclear RNAs
  • RNA Polymerasen und Transkription Im Unterschied zur DNA-Polymerase benötigt die RNA Polymerase keinen ‘Start-Primer’ RNA Polymerase entwindet die DNA Stränge (‘transcription bubble’) - Gyrasen und Topoisomerasen reduzieren positives supercoiling an der Front ‘Antisense Strand’ -entspricht der Sequenz des Matrizen-Strangs (‘template strand’) ‘Sense Strand’ -entspricht der Sequenz der mRNA Prinzipiell können mRNAs auf beiden DNA Strängen (gegenläufig) codiert werden Codierte mRNAs können auf dem DNA Strang überlappenDNA Strang wird im RNA-Polymerase Komplex stark geknickt, um die Transkriptionsblase zu stabilisieren
  • Initiation und Termination Initiation und Termination sind die wichtigstenRegulationsmechanismen bei der Transkription
  • Initiation der Transkription Grundlegende Struktur eines Promoters:• Startpunkt der Transkription (Position +1)• TATA-Box (‘Pribnow-box’, ‘-10-box’)• -35 Element RNA Polymerase hat eine hohe unspezifische Affinität zu DNA Sigma Faktoren (E.coli) schwächen die DNA Bindung und erhöhen die Bindung an spezifische Promoter nach Beginn der Transkription lösen sich die Sigma Faktoren von der RNA Polymerase Sigma Faktoren geben der RNA Polymerase Spezifität für bestimmte Promoter Familien
  • Termination der Transkription Rho-unabhängige Termination• GC-reiche Sequenzen auf der synthetisiertenRNA bilden eine ‘stem-loop’ Struktur• führt zur Termination Rho-abhängige Termination• Rho-Proteine folgen der RNA-Polymeraseund lösen den RNA-Strang and C-reichenKonsensussequenzen ab
  • Transkription in Eukaryoten Grundlegender Aufbau des basalen Promoters ist ähnlich wie in Bakterien  Initiation wesentlich komplexer als bei E.coli (Transkriptionsfaktoren, Chromatinstruktur,Enhancer, Silencer, etc.) TATA-Box (Position -30) und CAAT-Box (Position -80) als wichtige Elemente TFIIX (Transcription Factor for polymerase II) notwendig für Initiation
  • Initiation der Transkription in Eukaryoten TFIIX (Transcription Factor for polymerase II) notwendig für Initiation TFIID, TFIIA, TFIIB, TFIIF, TFIIE bilden mit der RNA-Polymerase einen Initiationskomplex um die TATA-Box RNA-Polymerase bindet, wird phosphoryliert -> Transkription started
  • Besonderheiten der Transkription in Eukaryoten die meisten eukaryotischen Gene bestehen aus Exons und Introns RNA Transkripte (hnRNA, heterogenous nuclear RNA) werden mit einem 5’-7mG Cap versehen RNA Transkripte werden mit einem poly-A Schwanz versehen Introns werden durch ‘splicing’ aus den RNA Transkripten entfernt RNA Transkripte (hnRNA, heterogenous nuclear RNA) werden mit einem 5’-7mGCap versehen Anschließend weitere Methylierung der 2’-OH Gruppen der nachfolgenden Basen 5’-7mG Cap stabilisiert mRNA und ist für die Translation wichtig RNA Transkripte werden an der Konsensussequenz für Polyadenylierung geschnitten Poly(A)-Polymerase fügt poly(A)- Schwanz an (nA= 150-200) Poly(A)-Schwanz stabilisiert die mRNA
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  • Anmerkungen zu Promoter in Eukaryoten nicht alle Promoter müssen eine TATA-Box besitzen Promoter-Elemente können in alternativen Kombinationen gefunden werden sogenannte ‘Null-Promoter’ besitzen gar keine offensichtlichen Promoter-Elemente bestimmte Gene (z.B. Dystrophin-Gen) können ‘multiple Promoter’ besitzen ! ‘Enhancer’ Elemente wirken verstärkend auf die Transkription und steuern gewebespezifische Expression
  • Splicing Introns werden durch ‘splicing’ aus der hnRNA entfern ‘Splicing’ wird von einem Ribonukleoproteinkomplex (snRNPs), dem Spliceosome, bewerstelligt Nur prozessierte mRNA wird aus dem Nukleus transportiert
  • Exon-Intron Grenzen und Splicing Introns werden durch invariante 5’- Donor (GT bzw. GU) und 3’- Akzeptor Sequenzen (AG) markiert Normalerweise werden nur GU-AG Sequenzen des gleichen Introns erkannt und verwended Splicing erfolgt nicht streng sequentiell (1-2-3) von 5’ nach 3’, sondern in bestimmter Reihenfolge (z.B. 2-3-1)
  • Splicing Mechanismus Herausschneiden des Introns erfolgt über ein ‘Lariat’(Lasso)-Intermediat 5’-2’ Bindung zwischen dem 5’-G des Introns und dem 2’-OH eines Adeninrests an der Verzweigungsstelle 3’-OH des Exons greift die 3’-5’ Bindung der folgenden Intron-Exons Grenze an und setzt die Intron-Lariat Struktur frei Herausschneiden des Introns erfolgt über zwei Transesterifikation Reaktionen
  • Das Spliceosome ‘Splicing’ wird von einem Ribonukleoproteinkomplex (snRNPs), demSpliceosome, bewerstelligt (U1, U2, U4, U5, U6 snRNAs) Der ‘Exon Junction Complex’ (EJC) bindet REF-Protein und TAPTransport Faktor für den Kern-Export der fertig prozessierten RNA
  • Anmerkungen zum mRNA Splicing Splicing wird in niederen Eukaryoten (z.B. Hefe) eher selten verwendet Splicing wird in vielen Organismen als Ersatz zu ‘Multigenfamilien’ verwendet (Drosophila) ‘kryptische Splice-Stellen’ können ein Problem darstellen
  • Splicing von tRNA Herausschneiden von Introns aus tRNAs erfolgt in zwei Schritten Endonuklease schneiden an den Enden des Introns Splicing Ligase verbindet die freien Enden der Exons
  • rRNA Processing Eukaryotische rRNAs werden durch Spaltung und Trimmen aus einer gemeinsamen Vorläufer-RNA generiert
  • Chemische Modifikationen von rRNA und tRNA Codon-Anticodon Erkennung: tRNAs können mehr als ein Codon erkennen Funktion in rRNA: nicht klar, möglicherweise enzymatische Aktivität bei derPeptidsynthese??
  • Self-Splicing rRNA in Tetrahymena kann sich ohne die Beteiligung von Proteinen splicen Guanin Nukleotid als Co-Faktor spaltet die erste Phosphoester-Bindung katalytische Aktivität wird durch die Struktur des Introns gebildet
  • Anmerkungen zum Self-Splicing - katalytische Aktivität von RNA -> Konzept des Ribozyms selbstspleißende Introns: einige Introns der Gruppen I, II, und III Ribonuklease P: katalytischer RNA-Anteil im Enzym zur 5’- Prozessierung von bakteriellen tRNAs ribosomale RNA: katalytischer RNA-Anteil bei der Peptidyltransferase-Aktivität in der 23S-rRNA Untereinheit Viren RNA Genom: z.B. Replikation von Viroiden (‘Hammerhead Ribozyme’)
  • Protein Splicing Inteine sind ‘Self-Splicing Protein Domains Inteine sind ‘parasitäre’ Protein Domänen
  • RNA-Processing - Editing Sequenzspezifische Deaminierung von Cytosin und Adenin verändert die kodierende Sequenz der mRNA C->U Editing des Apolipoprotein-B im Darm führt zu einer verkürzten Variante A->Inosin Editing des Glutamat-Rezeptors verändert die Primärsequenz und damit dieLeitfähigkeit des Ionenkanals
  • RNA-Processing - Editing durch ‘Guide RNAs’ Die Sequenz einer pre-mRNA wird entsprechend der Vorgabe einer ‘Guide RNA’ editiert Komplementäre Paarung von premRNA und ‘guide RNA’ Einfügen von Uridin-Resten in die pre-mRNA

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