Biologie (Subject) / PB III Praktikum (Lesson)

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• Mariendistelfrüchte Extraktion der Droge 5,000 g pulverisierte Droge wird mit 100 ml MeOH in einer Soxhletapparatur auf dem Wasserbad extrahiert und auf 30 mL am Roti eingeengt Lsg. wird in einen 50 mL Messkolben filtriert und mit MeOH (HPLC) auf 50 mL verdünnt die Untersuchungslösung wird in ein HPLC-Gefäß überführt und dort analysiert
• Absorption Bsp. bathochrome und hypsochrome Verschiebung Hydroxyfunktion: bathochrome Verschiebung in Richtung höherer Wellenlängen Keto- bzw. Aldehydstruktur: hypsochrome Verschiebung in Richtung kleinerer Wellenlängen
• Benzylpenicillin β-Lactam-AB Wirkmechanismus: Hemmung der Transpeptidase keine orale Bioverfügbarkeit β-Lactamaselabil
• COSY 2D-Methode Darstellung der Kopplung zwischen benachbarten H-Atomen NMR-Spektrum mit 2 Frequenzachsen Diagonal-Peaks entsprechen dem 1D-Spektrum Cross-Peaks zwischen Protonen, die miteinander koppeln
• Piperin Wirkungen Reizung von Schmerz- und Thermorezeptoren Anregung der Magensaftproduktion insektizid Hemmung der Lipidoxidation antixodative Wirkung PPARα-Agonist Regulation des Fettstoffwechsels antihypertensiv durch Blockade von Ca-Kanälen
• Piperin Isolierung 30g zerkleinerte Droge in einer Soxhlet-Apparatur (100 mL9 mit EtOH 2h extrahieren den gewonnenenExtrakt zur Trockene einengen den Rückstand in ethanolischer KOH 10% aufnehmen (15 mL) (Abtrennung anderer Bestandteile bzw. Chavicin) Piperin kann unter diesen Bedingungen zu Piperidin und Piperinsäure gespalten werden filtrieren der Lösung zum Abtrennen unlöslicher Bestandteile Unterkühlen der Lösung (Kristallbildung) Abnutschen Gefriertrocknung der Kristalle Identitätsprüfung mit DC mit Toluol/Ethylacetat 7/3 und Piperin als Referenz Detektion bei 254 nm (Fluoreszenzlöschung) und 366 nm (Fluoreszenzanregung) Besprühen mit Anisaldehyd Reinheit: keine zusätzlichen Spots Identität: gleiche Rf-Werte
• Indische Schlangenwurz Rauwolfiae radix Rauwolfia serpentina Apocynaceae (Hundsgiftgewächse)
• indische Schlangenwurz Inhaltsstoffe 0,8-2% Monoterpenindolalkaloide Reserpin (Leitalkaloid) Ajmalin (Hauptalkaloid) weitere Ajmalicin und Derivate 90% in der Wurzelrinde
• Reserpin Wirkung sympatholytisch durch Catecholaminverarmung: Inhibition der Monoamintransporter in der Membran der Speichervesikel Entspeicherung und Hemmung der Wiederaufnahme von NA peripher: sinkender Gefäßwiderstand und langanhaltender Blutdruckabfall
• Reserpin Anwendung Antihypertonikum bei leichter essentieller Hypertonie Sedativum bei erhöhtem Sympathikustonus verbunden mit Angst, Spannungszuständen und psychomototischer Unruhe UAW: depressive Verstimmung, beeinträchtigtes Reaktionsvermögen, Müdigkeit
• indische Schlangenwurz Praktikumsaufgabe photometrische Bestimmung des Gesamtalkaloidgehalts von Rauwolfiae radix Prinzip: freie extrahierte Base (Alkaloid) bildet mit dem sauren Azofarbstoff Eriochromschwarz-T farbige Salze lassen sich aus einer gepufferten Lsg. mit einem lipophilen LM ausschütteln Bestimmung der Menge an Farbstoff bei 520 nm, der in die organische Phase übergegangen ist
• Rauwolfiae radix Versuchsvorschrift 0,200 g gepulverte Droge + 40,0 mL DCM, schütteln +0,5 mL Ammoniak (25%): 30 min lang häufges, kräftiges Umschütteln extrahieren über Watte in einen 100 mL Jodzahlkolben filtrieren 10,0 mL Filtrat abrotieren, 5 mL Isopropanol zusetzen und erneut zur Trockene eindampfen Rückstand mit 2,0 mL DCM aufnehmen und in einen Scheidetrichter überführen Scheidetrichter: +20 mL DCM + 10,0 mL Citrat-Pufferlösung pH 4,0 R + 3 mL Eriochromschwarz-T-Lösung 3 mal mit je 20 mL DCM ausschütteln die rotgefärbten organischen Phasen in einen 100 mL Messkolben filtrieren, der 10,0 mL MeOH enthält mit DCM auf 100,0 mL auffüllen und bei 520 nm die Absorption vermessen
• Johanniskraut Systematik Droge: Hyperici herba Stammpflanze: Hypericum perforatum Familie: Hypericaceae Hauptinhaltsstoff: wirksam: Naphthodianthrone und Phloroglucinderivate weitere: Flavonoide, äth. Öl Indikation gemäß ESCOP: leichte bis mittelschwere depressive Episoden
• Johanniskraut Wirkmechanismus Re-Uptake-Inhibition von Neurotransmittern (unspezifisch) aus synaptischem Spalt (Hyperforin) Regulation des neuro-endokrinen Regelkreises (Hypothalamus-Hypophyse-Nebennierenrinde) Naphthodianthrone (Hypericin) Synergieeffekt: Einsatz des Extraktes
• Isolierung Hypericin Extraktion in der Wärme mit Wasser-THF-Gemisch (unter Rückfluss, zweimalig) abgetrennte Lösung eindampfen Rückstand in MeOH aufnehmen (25 mL) Verdünnungsschritt (MeOH): 5,0 mL auf 25 mL photometrische Bestimmung gegen MeOH bei 590 nm
• Chinarinde allgemein Stammpflanze: Cinchona pubescens Familie: Rubiaceae (Rötegewächse) Droge: Cinchonae cortex Inhaltsstoffe: Alkaloide: Chinin (Leitalkaloid), Cinchonin, Chinidin, Cinchonidin Gerbstoffe Anwendung: Amarum bei Wadenkrämpfen Malaria
• Alkaloidbestimmung aus der Chinarinde Versuchsdurchführung Aufgabe: Simultan-Gehaltsbestimmung von Chinin und Cinchonin in Cinchonae cortex Durchführung: Droge mit Wasser und HCl 30 min. erhitzen, dient der Extraktion der Alkaloide, die in der Droge mit Gerbstoffen komplexiert vorliegen Zugabe von DCM, Ether und NaOH und 30 min schüttel: Alkaloide liegen deprotoniert in der org. Phase vor Tragant zugeben, schütteln, filtrieren, waschen des Rückstandes: Abtrennen anderer Pflanzeninhaltsstoffe vollständiges Eindampfen, in EtOH aufnehmen und 5 mL davon wieder eindampfen Rückstand in HCl 0,1 M zu 100,0 mL lösen: Alkaloide liegen deprotoniert vor 10,0 mL dieser Lösung mit HCl 0,1 M zu 100,0 mL verdünnen Untrersuchungslösung und Referenzllösungen photometrisch bei 316 und 348 nm vermessen
• Chinarinde allgemein Droge: Cinchonae cortex Stammpflanze: Cinchona pubescens (Chinarindenbaum) Fam.: Rubiaceae (Rötegewächse, Kaffeegewächse(?)) Leitalkaloid: Chinin (weitere: Chinidin, Cinchonin, Cinchonidin) Anwendung: Droge als Bittermittel bei Wadenkrämpfen (Blockade von ionenkanälen) bei Malaria (keine Hämpolymerisation, toxisch für Schizonten)
• Chinarinde Praktikumsversuch Verfahren B gepulverte Droge mit Wasser und verd. HCl versetzen, 30 min. kochen (Freisetzung der Alkaloidfraktion aus Gerbstoffkomplexen) Ausschütteln der alkalischen Lösung mit DCM eindampfen, Rückstand in EtOH aufnehmen, erneut eindampfen Rückstand in HCl lösen und bei 316 und 348 nm photometrisch vermessen neben den Messwerten der Probe fließen in die Berechnung auch die Absorptionen der ebenfalls vermessenen Referenzlösungen (Chinin und Cinchonin) ein
• Chinarinde Prinzip der Gehaltsbestimmung Methoxygruppe erhöht über +I-Effekt die Elektronendichte im Chinlonring und bedingt so eine bathochrome Verschiebung desweiteren sorgt die HCl für einen hyperchromen Effekt: Erhöhung des Absorptionskoeffizienten ε → höhere Spezifität beide Chromophore absorbieren bei 316 und 348 nm mit jeweils verschiedenen Absorptionskoeffizienten Lambert-Beer: A=ε*c*d der Gehalt beider Chromophore lässt sich rechnerisch ermitteln (2 Gleichungen mit 2 Unbekannten)
• Absorptionsverschiebungen Bandenlage λ: bathochrom (rot) hypsochrom (blau) Bandenintensität ε: hyperchrom (+) hypochrom (-) bathochromer Effekt: Verschiebung in den längerwelligen/energieärmeren Bereich des Spektrums (v.a. +M,+I-Effekte) hypsochromer Effekt: Verschiebung in den kürzerwelligen Bereich des Spektrums hyperchromer Effekt: Erhöhung der Intensität hypochromer Effekt: Erniedrigung der Intensität
• Versuch Coffeinisolierung Droge und Stammpflanze Droge: Theae folium Stammpflanze: Camellia sinensis Familie: Theaceae Anbaugebiete: u.a. Indien, China, Japan Indikationsgebiet: Stimulans (Tonikum), Genussmittel, Durchfall (Gerbstoffe)(?) Hauptinhaltsstoffe: Coffein Spuren anderer Methylxanthine (Theobromin, Theophyllin) Polyphenole (v.a. Catechinderivate) Theanin Variationen: schwarzer Tee, grüner Tee
• (grüner) Tee zellprotektive Wirkung Grüner Tee enthält Polyphenole, welche antioxidativ wirken
• Isolierung von Coffein aus Theae folium Praktikumsversuch 50,0 g Droge pulverisieren Pulver mit ca. 500 ml dest. Wasser 15 min. lang kochen über Watte filtrieren mit etwa 400 ml dest. Wasser wird der Rückstand erneut aufgekocht dem Filtrat 150 mL 10%ige Bleiacetat-lsg. hinzugeben, gelber Nds. aus Catechinen und komplexiertem Pb2+ (Komplexierung OH-Gruppen an 3' und 4') überschüssiges Blei mit Schwefelsäure fällen (als Bleisulfat) Aktivkohle zugeben und Lösung auf 200 mL einengen kühle Lsg. mit Ammoniak auf pH 8 einstellen im Scheidetrichter 4mal mit je 50 mL DCM ausschütteln lipophile Phase über Calciumchlorid filtrieren DCM-Phase vollständig einengen Rückstand in Aceton aufnehmen, erhitzen und erneut filtrieren Lsg. bei 4°C im Kühlschrank lagern wenn keine Auskristallisation erfolgt, wird die Lsg. auf -80°C heruntergekühlt die erhaltenen Kristalle sofort abfiltrieren und gefriertrocknen Prüfung auf Reinheit mittels HPLC und DC DC: Fließmittel Ethylacetat/MeOH/Wasser 100/16,5/13,5 bei 17 cm Laufstrecke Auswertung bei 254 nm Referenz und Probe in Aceton lösen
• Digitalis purpurea Purpurroter Fingerhut, Plantaginaceae Inhaltsstoffe: Cardenolide der Reihen A, B, E (0,3-0,6%) Herzwirksame Digitanolglykoside Steroidsaponine Flavonoide Verwendung: Ausgangsmaterial zur Gewinnung von Reinstoffen Zubereitungen aus der Droge sind obsolet! ggf. standardisiertes eingestelltes Digitalis-purpurea-Pulver aus DAB 1999 abgeben HWG-Wirkwertbestimmung: Meerschweinchentest nach DAB
• Digitalis purpurea Analytik Gehalt nach Ph.Eur.6 Extraktion: 1h mit Wasser schütteln und filtrieren Erhitzen: 1h unter Rückfluss mit HCl 15% kochen (Hydrolyse der Zucker) Ausschütteln: 3mal mit DCM und trocknen über Natriumsulfat Eindampfen: vorher auf 100 mL mit DCM verdünnen, davon 40 mL auf dem Wasserbad eindampfen Aufnahme in Reagenz: 7mL 50% EtOH und 1 mL NaOH 1N lösen, mit 2 mL Dinitrobenzoesäure versetzen (Keddereaktion) photometrische Gehaltsbestimmung bei 540 nm über 12 min bis zum Maximum vermessen (Vermessung gegen Referenz bekannter Konzentration)
• Berechnung des Gehaltes HWG aus Digitalis purpurea MasseProbe=(MasseReferenz*AProbe)/AReferenz
• HWG Gehaltsbestimmung Fehlerquellen Probe muss KOCHEN! lange genug ausschütteln richtig messen (instabiler Meisenheimer Komplex) Konkurrenzreaktion: Hydrolyse des Lactonrings im Alkalischen Erfassung anderer CH-acider Verbindungen (Aceton und Acetaldehyd in EtOH enthalten, Digitanolglykoside in Droge enthalten, z.B. Purprogenin, Digacetigenin)
• Efeu Efeublätter - Hederae folium Stammpflanze: Efeu (Hedera helix) Familie: Araliengewächse (Araliaceae)
• Efeu Verwendung Herstellung von Efeublättertrockenextrakten für Hustensaft, Tropfen, Tabletten und Suppositorien
• Efeu pharmakol. Wirkung expectorierend (α-Hederin indirekter β2-adrenerger Effekt) leicht bronchospasmolytisch
• Efeu Indikationen Husten mit übermäßig starker Sekretion von viskösem Schleim Adjuvans zur Behandlung entzündlicher Bronchialerkrankungen
• Efeu Versuchsdurchführung 1,00 g pulverisierte Droge in einem 250 mL Rundkolben mit 50 mL Wasser/MeOH (20/80) versetzen Mischung 1h im Wasserbad bei 80°C unterRückflusskühlung erhitzen, abkühlen durch einen Wattebausch in einen 100 mL Messkolben filtrieren Wattebausch und Rückstand wie oben erneut erhitzen Ansatz filtrieren Filtrate vereinigen vor Verwendung Untersuchungslösung durch eine Membran filtrieren Identität DC (Hederacosid und α-Hederin als Referenz) HPLC (Hederacosid C) Elutionsmittel Acetonitril, Wasser, Phosphorsäure, Gradient
• Gehalt an Hederacosid C (bezogen auf die getrocknete Droge) berechnen (F1*m2*100)/(F2*m1*(100-d)) F1=Fläche des Peaks von Hederacosid C im Chromatogramm der Untersuchungslösung F2=Fläche des Peaks von Hederacosid C im Chromatogramm der Referenzlösung d=Trocknungsverlust in % m1=Einwaage der Droge in Gramm m2=Masse von Hederacosid C in der Referenzlösung
• Gerbstoffe - Drogen im Praktikum Eichenrinde - Quercus cortex Quercus robur/petraea Fagaceae Teeblätter - Theae nigrae folium Camellia sinensis Theaceae Bärentraubenblätter - Uvae ursi folium Arctostaphylos uva-ursi Ericaceae Chinarinde - Chinae cortex Cinchona pubescens/ledgeriana Rubiaceae
• Praktikumsvorschrift Gerbstoffe - Camellia sinensis fein gepulverte Droge 15 min unter Rückfluss mit 40 mL 30%igem MeOH zum Sieden erhitzen abkühlen lassen und in einen 50 mL Messkolben überführen, mit 30%igem MeOH auffüllen und filtrieren 5 mL Filtrat mit 25 mL Natriumacetat-Pufferlösung pH 5,1 versetzen und mit Wasser auf 50,0 mL auffüllen (Lösung 1) 20,0 mL Lösung mit 100 mg Casein versetzen und 1h schütteln, anschließend filtrieren (Lösung 2) je 5,00 mL Lösung 1 und 2 mit je 2,0 mL Folin-Ciocalteus-Phenolreagenz und 20 mL Wasser versetzen, mit Natriumcarbonat-Lösung auf 50,0 mL auffüllen nach 40 min Absorption bei 720 nm messen Vergleichslösung: 10,0 mg Gallussäure in 100 mL Wasser lösen und mit Natriumacetat-Pufferlösung pH 5,1 auf 200,0 mL verdünnen 5,0 mL der Lösung mit 2,0 mL Folinreagenz sowie 20,0 mL Wasser versetzen und mit Natriumcarbonat-Lösung auf 50,0 mL auffüllen nach 40 min wie oben vermessen gegen Blindlösung Blindlösung: 2,5 mL Natriumacetat-Pufferlösung pH 5,1 2,5 mL Wasser 2,0 mL Folin-Ciocalteus-Phenolreagenz 20,0 mL Wasser mit Natriumcarbonat auf 50,0 mL ergänzen
• Gerbstoffe - Ansetzen zweier Lösungen (warum?) Ansetzen zweier Lösungen: Erfassung aller oxidierbaren Phenole Erfassung übrig gebliebener oxidierbarer Phenole nach Ausfällen der Gerbstoffe mit Casein Wolfram (VI) und Molybdän (VI) werden reduziert zu Wolframblau (IV) und Molybdänblau (IV) → in der Folin-Ciocalteus-Phenollösung enthalten Gehälter werden voneinander abgezogen und man erhält den Gehalt aller mit Casein ausfällbarer Gerbstoffe
• Ginkgo Inhaltsstoffe Flavonoide (mind. 0,5% nach Ph. Eur.) Flavonolmono- und diglykoside basierend auf Kämpferol und Quercetin Biflavone, z.B. Bilobetin und Ginkgetin Diterpenlactone Ginkgolide A, B, C, J (0,02-0,2%) Sesquiterpenlactone Bilobalid (0,02-0,06%) Anacardsäuren unerwünscht, da toxisch und allergen Ginkgolsäure (Höchstgrenze 5ppm) Ginkgowirkung kommt durch Mischung zustande
• Penicillium chrysogenum: Arbeitsschritte für die Identifizierung DNA-Isolierung PCR (Polymerase Chain Reaction) Aufreinigung mit Gelelektrophorese Gelextraktion Sequenzierung BLAST
• Penicillium chrysogenum DNA-Isolierung Zerstörung der Zellmembran der zu untersuchenden Pilzmycelien Lysepuffer zerstört die Zellen → DNA bleibt in Lösung Abzentrifugation von Proteinen und Zelltrümmern im ersten Schritt Abzentrifugation mit Silikamembran aus dem Filtrat DNA fällen und mit Silikamembran von Lösung trennen mehrmals waschen und am Ende lösen
• Penicillium chrysogenum Puffer Lysepuffer: Tenside und Chitinasen Zerstörung der Zellmembran und Zellwand Fungal/Bacterial DNA Binding Puffer: leicht alklisch → neg. Ladung von DNA und RNA Prewash Buffer: Chelatkomplexbildner für Proteine Fungal/Bacterial DNA Wash Buffer: Trennung RNA von DNA Elution Buffer: leicht sauer → Protonierung der DNA und Elution von der Silikasäule
• ITS1 und ITS4 "internal transcribed spacers" nicht codierender rRNA-Abschnitt Platzhalter zwischen codierenden rRNA-Abschnitten hohe Genvariabilität zwischen nah verwandten Organismen, da geringer Selektionsdruck eindeutige Identifizierung des Organismus möglich
• ITS1 und ITS4 ITS1 forward primer ITS4 reverse primer Amplfizierung des Gens exponentiell (2n Kopien), bei einem Primer nur linear
• Penicillium chryogenum Aufreinigung Gelelektrophorese mit DNA-Leiter (verschiedene Basenpaarlängen) Fluoreszenzmarker: SYBR-Safe → Interkalation des Farbstoffs mit der DNA DNA-Banden bei 550 bp werden herausgeschnitten und weiter verwendet
• Penicillium chrysogenum Gelextraktion Agaroseausschnitte in ADB-Puffer inkubieren Abtrennung der DNA mit Zentrifugationssäule und waschen DNA lösen und färben (Interkalationsfarbstoff) Gelelektrophorese durchführen Absorptionsmessung zur Konz. Bestimmung DNA-Leiter als Referenz
• Rosskastanie Stammpflanze: Aesculus hippocastanum Familie: Sapindaceae Verbreitung: auf der Balkanhalbinsel; in Griechenland, Mazedonien, Albanien Habitus: sommergrüner, bis zu 30 m hoher Baum mit rundlicher Krone, weiße Blüten Blütezeit: April/Mai bis Juni Kapselfrüchte reifen im September/Oktober Arzneipflanze des Jahres 2008, Baum des Jahres 2005
• Rosskastanie - Droge lat.: Hippocastani semen Stammpflanze: Aesculus hippocastanum getrocknete, zerkleinerte Samen wird überwiegend aus Osteuropa importiert Teezubereitungen nicht gebräuchlich, nur in Phytopharmaka empfohlen werden 100 mg Aescin/Tag
• Rosskastanie Inhaltsstoffe für arzneiliche Verwendung verantwortliche Inhaltsstoffe: Triterpensaponine β-Aescin: komplexes Gemisch von mehr als 30 verwandten Einzelverbindungen Kryptoaescin: hämolytisch unwirksame Verbindung, die durch Acygruppenwanderung von C22 zu C28 entsteht α-Aescin: wasserlösliches Gemisch aus β-Aescin und Kryptoaescin
• Rosskastanie sonstige Inhaltsstoffe Cumarine (Aesculin, Fraxin) Flavonoide (Quercetin, Kämpferol) Gerbstoffe Zucker fettes Öl Sterole und Methylsterole geringe Mengen äth. Öl (Nonanal, Benzylalkohol) Proteine
• Rosskastanie Wirkung und Indikation Wirkungen: antiexsudativ antiphlogistisch ödemprotektiv venentonisierend vermuteter Wirkmechanismus: Hemmung der lysosomalen Enzyme, wie der Hyaluronidase (Hyaluronsäure ist Hauptbestandteil der extravaskulären Matrix) Indikationen: CVI zusammen mit physikalischen Maßnahmen

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