AMA (Subject) / COX-Inhibitoren (Lesson)

Analytik, Med.Chemie

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• COX allgemein Cyclooxygenasen (COX) sind die wesentlichen Enzyme am Anfang der Prostaglandinsynthese aus Arachidonsäure, der Dihomogammalinolensäure (DGLA) oder der Eicosapentaensäure (EPA). Dieser Schritt wird durch Nichtsteroidale Antiphlogistika gehemmt und ist der geschwindigkeitsbestimmende Schritt in der Prostaglandinsynthese. Die COX haben daher eine zentrale Funktion in der Regulation des Entzündungsgeschehens. Cyclooxygenasen sind im Inneren des endoplasmatischen Retikulums, innerhalb der Kernhülle und im Golgiapparat lokalisiert und haften den Innenseiten der Membranen dieser Zellkompartimente an. Sie kommen in Zellen von Tieren seit der frühen Entwicklung der wirbellosen Tiere vor, z. B. schon in Zellen der Koralle, nicht jedoch in einzelligen Organismen, Pflanzen oder Insekten. Hier kommen jedoch verwandte Enzyme aus der übergeordneten Familie der Pathogen-induzierbaren Oxygenasen (PIOXs) vor. Es gibt bereits sehr früh in der Evolution der Cyclooxygenasen zwei Isoenzyme, die Cyclooxygenase-1 und die Cyclooxygenase-2, die sich durch ihren Genlocus unterscheiden, eine leicht unterschiedliche Struktur haben, in verschiedenen Zelltypen vorkommen, unterschiedlich reguliert werden, eine unterschiedliche Substratspezifität zeigen und pharmakologisch unterschiedlich beeinflussbar sind
• COX Struktur Cyclooxygenasen sind globuläre Proteine mit ca. 600 Aminosäuren. Sie haben eine Molare Masse von 67 bis 72 kDa, sind zu 65 % gleich in ihrer Aminosäurensequenz und haben nahezu identische aktive Zentren. Sie fügen sich je zu zwei Dimeren zusammen. Mit einer hydrophoben Region schwimmen sie auf/in den Innenseiten der mikrosomalen Membranen z. B. des endoplasmatischen Retikulums. Diese membranbindende Region bildet eine ebenfalls hydrophobe, enge Öffnung in einen blind endenden Kanal zu dem aktiven Zentrum mit der Cyclooxygenaseaktivität. Dieser Kanal ist in der Cyclooxygenase-1 enger als in der Cyclooxygenase-2 (durch einen Austausch an Position 523 von Isoleucin in Valin). Im inneren Teil des Kanals befindet sich (an Position 385) ein Tyrosin, welches zu einem Tyrosyl-Radikal aktiviert wird, bevor die Cyclooxygenasen ihre eigentliche Reaktion ausführen können. Dies geschieht mit Hilfe der Peroxidaseaktivität der Cyclooxygenasen, welche in einem anderen aktiven Zentrum (an der der Membran des endoplasmatischen Retikulums gegenüberliegenden Seite des Enzyms) liegt. Hier wird zunächst mit Hilfe von im endoplasmatischen Retikulum vorkommenden Oxidantien an Häm gebundenes Fe3+ zu einem Ferryl-Oxo-Porphyrin-Radikal (Fe4+=O•) oxidiert, welches dann ein Elektron vom Tyrosin-OH im Zentrum der Cyclooxygenaseaktivität abzieht und so das aktive Radikal Tyrosyl-O• bildet.
• COX Funktion Die Cyclooxygenasen katalysieren die Umwandlung von Arachidonsäure zu Prostaglandin-H2, bzw. auch der DGLA und EPA zu den entsprechenden Vorläufern der PG1 und PG3. Dies geschieht in zwei Schritten in zwei unterschiedlichen Reaktionszentren des Enzyms: Der erste Reaktionsschritt findet im oben beschriebenen katalytischen Zentrum mit der Cyclooxygenaseaktivität statt. Dabei wird ein Ringschluss zwischen den Kohlenstoffatomen C8 und C12 erreicht sowie zwei Sauerstoffatome an C9 und C11 eingefügt, die anschließend eine kovalente Bindung miteinander eingehen, so dass eine Peroxidbrücke im Prostaglandin-G2 entsteht (genaueres siehe in [1]). Das entstandene Prostaglandin-G2 diffundiert aus dem Kanal heraus. Der zweite Reaktionsschritt wird durch das Reaktionszentrum mit Peroxidaseaktivität katalysiert: hier wird das Prostaglandin-H2 aus dem Prostaglandin-G2 gebildet. Aus dem entstandenen Prostaglandin-H2 werden dann teilweise durch spontane Isomerisation, teils mit Hilfe verschiedener Synthasen oder Oxidasen die unterschiedlichen anderen Prostaglandine synthetisiert. Die Cyclooxygenasen sind aber bei der Prostaglandinbildung der geschwindigkeitsbestimmende Schritt, sie haben so eine zentrale Stellung in der Regulation des Entzündungsgeschehens. Sie haben eine Halbwertzeit von 1-2 Minuten, wenn sie Arachidonsäure in einer Konzentration ausgesetzt sind, die zu maximaler Auslastung des Enzyms führen
• COX Unterformen Es gibt zwei Unterformen der Cyclooxygenasen. Sie haben sich früh in der Evolution der wirbellosen Tiere durch Genduplikation voneinander getrennt und gehen seither ihre eigenen evolutionären Wege. Sie haben 65 % der Aminosäuresequenzen gemeinsam, katalysieren dieselbe enzymatische Reaktion, finden sich aber im Organismus unterschiedlich verteilt und reguliert. Ein wichtiger Unterschied zwischen der Cyclooxygenase-1 und der Cyclooxygenase-2 ist der Austausch an Position 523 von Isoleucin gegen Valin, welches das aktive Zentrum der Cyclooxygenase-2 etwas größer macht und dort auch etwas sperrigere Substrate außer Arachidonsäure oxidieren kann. Dies ist zum Beispiel für Endocannabinoide wie zum Beispiel Anandamid möglich. Ein weiterer Unterschied ist die vielfache Regulation der Transkription der Cyclooxygenase-2, die vor allem durch Entzündungsprozesse und andere Bedingungen der Zellaktivierung induziert wird. Mittlerweile wurde auch eine weitere Cyclooxygenase-Isoform – Cyclooxygenase 3 – proklamiert. Ein Beweis oder eine genauere Definition konnte allerdings noch nicht gegeben werden. Allerdings soll Paracetamol COX-3 hemmen. Inzwischen wird davon ausgegangen, dass es sich bei COX-3 lediglich um eine splice-Variante der COX-1 handelt.
• COX-Inhibitoren Säure-Funktion Säurefunktion ist wichtig basisch wäre auch möglich, aber man müsste ein Vielfaches der Substanzen nehmen (Dosis)
• isokratische Elution Elutionsmittelzusammensetzung bleibt konstant geeignet bei Substanzen mit geringen Retentionsunterschieden
• Gradientenelution Änderung der Elutionsmittelzusammensetzung während des Laufs Erhöhung der Elutionskraft = Verkürzung der Elutionszeit Anwendung bei Substanzen mit großen Retentionsunterschieden
• HPLC-Analytik Chromatogramm äußeres Chromatogramm: getrennte Substanzen verlassen nacheinander die Trennstrecke der mobilen Phase Aufzeichnung erfolgt in Abhängigkeit von der Zeit Totzeitbestimmung mit Thioharnstoff t0 = Totzeit = Laufzeit einer nicht verzögerten Komponente tR = Retentionszeit t'R = Netto-Retentionszeit = tR-t0
• Kapazität und Kapazitätsfaktor k' = Kapazitätsfaktor sollte zwischen 1 und 5 liegen k'=t'R/t0=(tR-t0)/t0 unabhängig von: Säulenlänge Flussgeschwindigkeit des Eluenten
• Streu-Diffusion/Eddy-Diffusion unterschiedliche Wege zwischen den Säulenpartikeln = unterschiedliche tR je einheitlicher die Packungsdichte + Korngrößenverteilung, desto kleiner die Streudiffusion Effekt abhängig von Strömungsgeschwindigkeit u H = Trennstufenhöhe
• Längsdiffusion Brown'sche Molekulardiffusion normale Diffusion infolge der Molekularbewegung Effekt umso kleiner, je größer die Strömungsgeschwindigkeit
• Massenübergang (Stoffaustausch) Adsorption/Desorption werden durch Strömung behindert Effekt wird mit zunehmender Strömungsgeschwindigkeit größer
• Van-Deemter-Gleichung Beschreibt Zusammenhang zwischen Trennstufenhöhe, Strömungsgeschwindigkeit und Diffusionseffekten
• MTT-Assay Durchführung Aussähen der Zellen nach 24 h Zugabe der Testsubstanzen in Nährmedium 72-stündige Inkubation der Zellen mit den Testsubstanzen Versetzen mit 25 µl MTT-Reagenzlösung/well (2mg MTT/ml PBS) Inkubation im Brutschrank (37°, 5% CO2, 96% Luftfeuchte) zur Formazanbildung Absaugen des Inkubationsansatzes (Attaches Zellen am Boden angewachsen/verankert, werden nicht abgesaugt) Versetzen mit 75 µl DMSO-Lösung/well (gutes LM für Formazan, löst die Zellen) Vermessen der Absorption bei 544 nm (Absorptionsmaximum Formazan in DMSO) und 690 nm (Nebenprodukte), Subtraktion
• Cisplatin Wirkmechanismus Prodrug: im Extrazellulärraum hohe Chloridkonzentration = Stabilisierung neutraler cDDPs nach Diffusion in die Zelle Abspaltung der Chlorliganden und Austausch gegen Wassermoleküle = Bioaktivierung

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