21
Genetik der Pflanzen (Subject) / Praktikum3 (Lesson)
Advertisement
- Welche Fragestellungen können mit transgenen Pflanzen untersucht werden? Einbringung von Fremdgenen um ihre Funktion in planta zu untersuchen Gain-of-function Analyse Loss-of-function Analyse Welche DNA Elemente müssen kloniert werden? 1)Protein-kodierende Region 2)Promoter (konstitutiver oder induzierbarer) 3)Selektionsmarker (z.B. Antibiotikaresistenz) Welche Vektoren werden dafür verwendet?–Pflanzenvektoren (Binäre Vektoren)–Chloroplastentransformation (Gold-particle-gun)
- Promotoren in transgenen Pflanzen --Wichtige Faktoren der Promotoren sind dabei: –Stärke der Expression–GewebsspezifitätDies kann durch einen geeigneten Promoter,der der Protein-kodierenden Regionvorangeschaltet wird bestimmt werden.
- Induzierbares Expressionssystem -Ausnutzung von Promoteren (regulatorischen Elementen) von “nicht-Pflanzen” Organismen (E.coli, Hefe oder Mensch) -Promoteren die durch spezifische Chemikalien aktiviert werden –Inducer-->Chemisch regulierte Genexpression
- Voraussetzungen für ein induzierbares System Inducer muss hochspezifisch für den Zielpromoter sein Nicht-toxisch für Pflanzen Einfache Applikation Sollte das Gewebe penetrieren billig Promoter(regulatorische Sequenz) Niedriger basaler Expressionslevel Hohe Expression nach Induktion
- Induzierbares Expressionssystem_-_Expression von zwei Genen in transgenen Pflanzen 1)Transkriptioneller Repressor oder Aktivator (Gen, welches für das regulatorische Protein codiert) 2) Zu untersuchendes Gen unter der Kontrolle eines geeigneten Zielpromotors
- Ethanol-induzierbares System Ethanol bindet an den Alkohol-regulierten Transkriptionsfaktor (AlcR) induziert eine Änderung der Konformation in AlcR AlcR kann an den AlcA Promoter binden und nachgeschaltetes Gen aktivieren
- Tetrazyklin-induzierbares System Tetrazyklin Repressor-basierend, Gram-negative Bakterien (E.coli) –Tetrazyklin Repressor (TetR) reguliert die Expression seines eigenen Gens (tetR) als auch die Expression des Tc Resistenzgens tetA. TetR bindet an zwei tetOperatoren, was zur Repression von beiden Genen führt Die Induktion basiert auf der Bindung von Tetrazyklin tc an tetR ->TetR-tc Komplex kann nicht mehr an die DNA binden
- Reportergen-System. Beispiele für reporter gene und Funktion. 1.GUS (uidA) Gen2.Green fluorescent protein (GFP)3.Luciferasegen Funktion: Erlaubt die Beobachtung von Vorgängen in Organismen: Lokalisation bestimmter Proteine Regulation von Genen
- ß-Glucuronidase Gen (uidA, GUSGen) Aus E.coli In der Pflanzenmolekularbiologie als Reportergen genutzt um die Aktivität von Promotoren zu untersuchen Kodiert für ein Enzym, welches schon in sehr niedriger Konzentration eine farblose Substanz in ein farbiges Präzipitat umwandeln kann, wenn das Substrat zugefügt wird. 1)Quantitativefluorometrische Messung2)HistochemischeCharakterisierung eines Expressionsmusters -->Zellen in denen der Promotor aktiv ist werden blau gefärbt, während andere farblos bleiben
- Green fluorescent protein (GFP) Protein der Leuchtqualle (Aequorea victoria) Viele strukturelle Varianten des Gens erhältlich z.B. rot oder gelb leuchtende Varianten (RFP, YFP) GFP funktioniert in vielen heterologen Zelltypen (d.h. hat keine großen Anforderungen bezügl. Cofaktoren, oder posttranslationarer Modifikationen) Lebendfärbung (z.B. Transportvorgänge können sichtbar gemacht werden.) Nachteile: Fluoreszenzmikroskop (teuer) Autofluoreszenz von Chlorophyll in ähnlichem Bereich
- Advertisement
- Luciferase (luc) gene Nordamerikanisches Glühwürmchen (firefly) entlässt grünes Licht während der Oxidation des chemischen Substrates Luciferin Modifiziertes Protein LUC+ leuchtet stärker und ist cytoplasmatisch lokalisiert im Gegensatz zum nativen LUC, welches in Peroxisomen lokalisiert ist. Schwachlichtkameras können die Biolumineszenz mit hoher Sensitivität auch in lebenden Organismen detektieren man kann bewegte Vorgänge darstellen. Nachteil: Luciferin muss zugegeben werden. Teure Schwachlichtkameras
- Abweichungen von den Mendelschen Regeln, jeweils mit Bezug zur Molekularbiologie Multiple Allelie Kodominanz Letalfaktoren Geschlechtsgebundene Vererbung
- Wechselwirkungen zwischen allelen Genen Dominanz Unvollständige Dominanz Kodominanz Multiple Allelie Letalfaktoren (Hemizygotie: Geschlechtsgebundene Vererbung
- Wechselwirkungen zwischen nicht allelen Genen: Modifizierer Gene, die den Phänotyp (i.d.R. quantitativ) leicht modulieren Polygenie/ Redundanz mehrere Gene sind für eine Merkmalsausprägung verantwortlich zwei Mutationen in zwei Genen sind nötig für einen veränderten Phänotyp. Epistasie(bremsen, stoppen) eine Mutation in einem Gen verhindert (unterdrückt) die Ausprägung einer Mutation in einem anderen (nicht-allelen) Gen. Expressivität eine Mutation in einem Gen prägt den Phänotyp mit variablem Grad Penetranz eine Mutation in einem Gen prägt sich nicht in allen homozygoten Genträgern aus Wechselwirkungen zwischen nicht allelen Genen Pleiotropie(Polyphänie) eine Mutation in einem Gen bedingt eine mehrfache Veränderung im Phänotyp (multiple phänotypische Effekte)
- Dominante/rezessive Mutationen Fall 1: Die Produktion des ‘Wildtyp’-Proteins istausreichend(Schwelleneffekt), um den ‘Wildtyp’-Phänotyp auszuprägen: rezessiveMutation (Das Wildtyp-Allelist ‘haplo-sufficient’ und somit dominant.) Fall 2: Die Produktion des ‘Wildtyp’-Proteins ist nichtausreichend(Schwellenwert wird nicht überschritten), um den ‘Wildtyp’-Phänotyp auszuprägen: dominanteMutation (Das Wildtyp-Allelist ‘haplo-insufficient’ und somit rezessiv.)
- Kodominanz: beispiel Hämoglobine und Sichelzellenanämie Sichelzellenanämie wird verursacht durch das Sichelzellenhämoglobin (HbS), eine mutierte Form der der ß-Hb-Kette mit einer Glu -->Val Aminosäuresubstitution. In Homozygoten nehmen die roten Blutkörperchen bei O2-Mangel eine sichelförmige Gestalt an. Homozygote Träger sterben meist im Kindesalter. Heterozygotesind meist symptomfrei und haben eine normale Lebenserwartung (unvollständig dominanter Phänotyp). Die Malariaresistenz ist erhöht (Selektionsvorteil!). Die Expressionder Hämoglobinallele in Heterozygoten ist dagegen kodominant("molekularere Phänotyp"):
- Multiple Allelie "Multiple Allelie" ist das Vorkommen von mehr als zwei Allelen eines Gens in einer Population. Jede neu auftretende Mutation in einem Gen stellt ein weiteres Allel dar, auch wenn diese Mutation keinen neuen Phänotyp bewirkt „Multiple Allelie“ ist daher der Normalfall. Beispiel :Phenylketonurie (PKU)
- Kodominanz: beide Allele setzen sich vollständig durch: die Folge ist ein neuer Phänotyp Beispiel: das AB0 Blutgruppensystem
- Letalfaktoren Letalfaktoren sind entdeckt worden als rezessive Allele, die im homozygoten Zustand letal sind in heterozygoten Individuen keinen Phänotyp (Ausnahmen) Letalität kann bereits in der Embryonalentwicklung auftreten (Beispiel: Manx Gen bei Katzen, Yellow Gen) oder erst in späteren Lebensjahren (Beispiele: Cystische Fibrose, Duchenne Muskeldystrophie)
- Letalfaktoren Unterteilung nach: Unterteilung nach: letal, subletal/semivital (wenn der Letalfaktor nicht immer voll zur Ausprägung kommt. Ein Teil der Letalfaktoren folgt also nicht dem „alles oder Nichts“-Prinzip, sondern es gibt eine Variabilität in der Ausprägung) rezessiv(können vererbt werden), dominant(können im Normalfall nicht vererbt werden, sondern entstehen aus Neumutationen) autosomal, gonosomal Gametisch, gonisch, haplophasisch--zygotisch
- Beispiel für einen gametischen (gonischen) Letalfaktor Levkoje (Matthiola incana):•Pflanzen mit gefüllten Blüten sind steril. Heterozygote Pflanzen (einfach blühend) bilden nach der Selbstung jedoch Nachkommen im Verhältnis 1:1 statt 3:1. Erklärung durch einen (gonischen, pollenspezifischen) Letalfaktor, der eng mit dem Merkmal ‘gefüllte Blüte’ gekoppeltist (Rekombinationsfrequenz <1%). In der Nachkommenschaft erhält man also nur heterozygote einfach blühendeNachkommen und sterile homozygote Nachkommen mit gefüllten Blüten (1:1).