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Genetik (Subject) / DNA-Isolierung, PCR (Lesson)
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- Grundlegende Schritte zur DNA-Präparation Herstellung eines Zellextrakts → enthält DNA, RNA, Aminosäuren, Lipide, Peptide, komplexe Kohlenhydrate, einfache Kohlenhydrate, Ionen, Nukleotide, Cofaktoren → durch Disruption: komplettes Aufbrechen von Zellen, d.h. der Zellwände, Plasmamembranen und Organellen ist notwendig, um den kompletten DNA-Pool zugänglich zu machen → häufig Kombination aus mechanischen, chemischen und thermischen Maßnahmen → bei einem unvollständigen Aufschluss hat man eine signifikant niedrigere Ausbeute → man erhält als Ergebnis ein sog. Lysat Isolierung der DNA aus dem Zellextrakt → durch Alkohol-Fällung DNA wird mit reinem Ethanol (-20°C) überschichtet an der Grenzschicht bilden sich durch Ausfällung der DNA Fasern, die man mit einem Glasstab herausziehen kann Grund: Alkohol entzieht der DNA die Hydrathülle und macht sie dadurch unlöslich → durch Alkohol-Fällung mit monovalentem Salz (professionellere Methode) Kombination von Alkohol mit monovalenten Kationen der DNA wird so die Hydrathülle entzogen Kationen binden an die Phosphatreste und neutralisieren diese es fällt mehr DNA aus, als bei der ersten Methode Reinigung der DNA → in Ethanol wegen dem hohen Salzgehalt der Lösung Lagerung der DNA → wenn man gleich weiter arbeiten will, in Wasser → ansonsten: TE-Puffer (alkalisch, enthält EDTA → komplexiert zweiwertige Ionen, wodurch DNAsen gehemmt werden, die ein zweiwertiges Ion als Cofaktor benötigen) → in einer solchen Lösung ist die DNA über Jahre hinweg stabil
- Konkrete Möglichkeiten zum Zellaufschluss Konkrete Möglichkeiten zum mechanischen Zellaufschluss Mixer Ultraschall Homogenisatoren im Versuch: Gemüsereibe french pressing: Zellen werden mit sehr hohem Druck durch ein Nadelventil gedrückt; wenn die Zellen nach dem Ventil plötzlich in den Umgebungsdruck kommen, können sie platzen Beads: „Backen“ aus Metall, Keramik oder Glas, die sich schnell hin und her bewegen → z.B. auch in einer Kugelmühle Nach dieser mechanischen Behandlung werden die Zellen in einen Lysispuffer für den chemischen Aufschluss gegeben → zum Lösen von hydrophoben Substanzen → setzt sich aus einem hydrophoben und einem hydrophilen Teil zusammen → Lösung erfolgt über Micellenbildung In einem Lysispuffer sind meist folgende Enzyme enthalten: Proteinase K (Abbau von Proteinen, Freisetzung von Nukleinsäuren) Lyticase, Zymolase (Gemische zum Verdau pilzlicher Zellwände) Lysozym (Auflösung von bakteriellen Zellwänden) Im Versuch wurde eine Mischung aus Spülmittel, Salz und Wasser verwendet. Außerdem: thermischer Aufschluss durch Erhitzen
- Ablauf der DNA-Gewinnung im Praktikum Lysispuffer aus Spülmittel, Salz und Wasser herstellen Zucchini mit Küchenreibe zerkleinern und Zellbrei zum Puffer geben → 15 min im Wasserbad inkubieren Ansatz filtrieren und Lösung auf Eiswasser stellen -20°C kalten Spiritus zugeben ausgefallene DNA mit dem Glashaken entfernen und in RG mit Ethanol geben Vortexen (Befreiung der DNA von Salzen und Detergenzien) Pelletierung der DNA durch Zentrifugation DNA wird in TE-Puffer gegeben
- PCR - Begriff = Methode, um die DNA in vitro zu vervielfältigen → wenn man einen kurzen, genau definierten Teil eines DNA-Strangs vervielfältigen möchte (maximale Länge der Produkte ca. 10 000 Basenpaare) → man braucht dazu keinen lebenden Organismus (wie. z.B. beim Klonen)
- Grundprinzip der PCR 1. Denaturierung Durch Erhitzen wird die doppelsträngige DNA in zwei Einzelstränge aufgeteilt (96°C) 2. primer annealing: Anlagerung von sequenzspezifischen Primern An jeden Einzelstrang wird ein sequenzspezifischer Primer angelagert → Temperatur: 62°C CAVE: Es kann also nur solche DNA amplifiziert werden, von der mindestens eine kurze Sequenz bekannt ist, bzw. von der vermutet wird, dass eine bestimmte Sequenz vorhanden ist 3. DNA-Synthese (Elongation) Von den Primern ausgehend wird durch die DNA-Polymerase DNA synthetisiert → dadurch wird die Zielsequenz verdoppelt → Temperatur 72°C 4. Erneute Denaturierung usw. Die gewonnene DNA wird wieder durch Erhitzen in zwei Einzelstränge aufgeteilt und die PCR kann von vorne beginnen (96°C) Diese Schritte werden nun vielfach (meist 30 mal) wiederholt → im Idealfall verdoppelt sich bei jedem neuen Zyklus die Anzahl der DNA-Moleküle mit der Zielsequenz, da auch die jeweils neu gebildeten Moleküle als Matrize dienen
- Zyklen der PCR (anhand von einem Strang) Zyklen der PCR (anhand von einem Strang) 1. Zyklus Am Ende des 1. Zyklus (bzw. nach der Denaturierung am Anfang des 2. Zyklus) hat man 2 ursprüngliche Einzelstränge 2 am 3' Ende überlange Einzelstränge, weil zwar der Startpunkt durch den Primer festgelegt ist, nicht aber der Endpunkt 2. Zyklus mit der ursprünglich eingesetzten DNA passiert das Gleiche wie im 1. Zyklus bei den überlangen Strängen lagern sich die Primer am 3' Ende an und es wird ein Strang in der gewünschten Länge gebildet, weil das 5' Ende ja schon vorgegeben ist 3. Zyklus usw. die langen, unerwünschten Produkte vermehren sich linear (nur die ursprünglich eingesetzte DNA kann als Matrize dienen) die gewünschten kurzen Produkte vermehren sich exponentiell (jeder gebildete Strang dient im nächsten Zyklus selbst als Matrize)
- Wichtige Entwicklungen im Zusammenhang mit der PCR Zwei neue Technologien haben entscheidend dazu beigetragen, dass aus der PCR eine Schlüsseltechnik für die Wissenschaft wurde: Einsatz von hitzestabilen DNA-Polymerasen → früher verwendete man Polymerasen aus E.coli, die nach jedem Temperaturschnitt denaturiert wurden → vor jedem Zyklus musste man neue Polymerasen zugeben → heute verwendet man Polymerasen aus thermophilen Bakterien (gentechnisch oder natürlich gewonnen) → z.B. Taq (ohne proofreading), Pfu (mit proofreading) Entwicklung einfacher Geräte für die Steuerung der Temperaturzyklen (Thermocycler)
- Essentielle Komponenten der PCR Thermocycler DNA-Matrize DNA-Polymerase (thermostabil) Oligonukleotid-Primer → „forward-primer“ = sequenzidentisch zum oberen DNA-Strang → „reverse-primer“ = sequenzidentisch zum unteren DNA-Strang Desoxynukleosid-Triphosphate PCR-Puffer (konstanter pH, monovalente Kaliumionen, divalente Magnesiumionen)
- Einsatzbereiche der PCR Klonierung von Genen DNA-Sequenzierung DNA-Mutagenese Erkennung von Erbkrankheiten Erstellen von genetischen Fingerabdrücken und Vaterschaftstests Untersuchung von Verwandtschaftsbeziehungen Nachweis von Krankheitserregern → z.B. Bakterien, die gegen alle gängigen Antibiotika resistent sind (für die Resistenz sind ganz bestimmte Gene verantwortlich; diese können mit PCR amplifiziert werden) Einsatz in der Archäologie
- Funktionsprinzip der Agarose-Gelelektrophorese → zur Auftrennung von DNA-Fragmenten nach ihrer Größe (= Länge) DNA ist negativ geladen und wandert daher im elektrischen Feld zum + Pol bei der Agarose-Gelelektrophorese befindet sich im elektrischen Feld eine Gelmatrix, wodurch die DNA-Fragmente aufgetrennt werden können
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- Dichte der Gelmatrix bei der Agarose-Gelelektrophorese Durch die Dichte der Gelmatrix kann der Auftrennungsbereich der DNA-Fragmente beeinflusst werden: 1% Agarose-Gel: gut zur Auftrennung von großen Fragmenten → kleine DNA-Fragmente laufen zu schnell durch das Gel und werden daher schlecht aufgetrennt 2% Agarose-Gel: gut zur Auftrennung von kleinen Fragmenten → große DNA-Fragmente wandern schlecht ins Gel ein und trennen sich nicht auf
- Komponenten der Agarose-Gelelektrophorese Agarose-Gel mit → Laufpuffer (z.B. TAE) → Ethidiumbromid (interkaliert in DNA und fluoresziert unter UV-Licht; die Fluoreszenzintensität ist direkt proportional zur DNA-Menge) Gelkammer → mit Laufpuffer Spannungsquelle Probenauftragspuffer mit → Farbmarker (z.B. Bromphenolblau) → Substanzen zum Beschweren der Probe (z.B. Glycerin, Saccharose) damit sie in die Geltaschen eingebracht werden kann Im Probenauftragspuffer wird die DNA gelöst DNA-Längenstandard