Genetik (Subject) / Mutation (Lesson)

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• Begriff Mutation Mutation = erbliche Veränderung in der DNA-Sequenz Veränderungen in der DNA sind zunächst einmal DNA-Schäden.Nur dann, wenn es nicht zu einer Reparatur kommt und eine Weitergabe an die Nachkommen erfolgt, spricht man von einer Mutation. somatische Mutation: Mutation liegt in den Körperzellen Keimbahnmutationen: Mutation liegt in den Keimzellen Keimbahnmutationen werden an die Nachkommen weitergegeben, welche dann ein mutiertesSoma aufweisen. Somatische Mutationen werden nicht vererbt, spielen aber z.B. bei der Krebsentstehung eine Rolle
• Bedeutung Mutation Mutation sorgt gemeinsam mit Rekombination für Variation und macht so Evolution überhaupt erst möglich!
• Nachweis der spontanen Natur von Mutationen Mutationen treten in der Natur spontan auf und sind nicht Ergebnis von Selektionsdruck. Dies kann durch 2 Versuche nachgewiesen werden:   Luria-Delbrück-Fluktuationstest → wenn Mutation das Ergebnis von Selektionsdruck wäre, dann müsste bei gleichen Selektionsbedingungen in mehreren Zellkulturen eine ähnliche Mutationsrate vorliegen → wenn Mutation spontan und ungerichtet erfolgt, dann schwankt die Anzahl an Mutationen in mehreren Zellkulturen trotz gleicher Selektionsbedingungen; ausschlaggebend für die Mutationsrate ist der Mutationszeitpunkt → beim Plattieren von 20 E.coli Kulturen in ein Selektionsmedium schwankten die Mutationszahlen stark Replikaplattierung nach Lederberg → mit einem Stempel können Bakterienkolonien in gleicher räumlicher Anordnung von einem Nährmedium in ein anderes übertragen werden → Bakterien werden in einem Medium ohne Selektionsdruck herangezogen und dann in ein Medium mit Selektionsdruck übertragen → durch den Vergleich mit dem Originalmedium lassen sich sensitive oder resistente Kolonien identifizieren → auf verschiedenen Platten mit gleichem Selektionsdruck wachsen die gleichen Kolonien → d.h. Mutation fand schon vor der Replikaplattierung statt, als es noch keinen Selektionsdruck gab  
• Unterscheidung von Mutationen nach dem Ausmaß der Veränderung Punktmutation: Veränderung an einem oder nur wenigen Nukleotiden Transitionen Transversionen Inversionen Deletionen spontane Depurinierung spontane Desaminierung oxidative Zerstörung von Basen Chromosomenmutation: Veränderung an größeren Chromosomenabschnitten Deletion Insertion Inversion: es kommt zu einem Strangbruch und das Bruchstück fügt sich verkehrt herum wieder ein Translokation: Teilstücke brechen von einem Chromosom ab und werden an ein anderes Chromosom angeheftet Genommutation: Veränderung an der Anzahl  der Chromosomen entstehen durch Defekte am Spindelfaserapparat Polyploidie: Vervielfältigung der Chromosomensätze Aneuploidie: Veränderung der Anzahl einzelner Chromosomen (z.B. Trisomie)  
• Punktmutationen durch Basenaustausch   Arten von Austausch Transition → Purin wird durch Purin ersetzt, Pyrimidin durch Pyrimidin → kommt häufiger vor Transversion → Purin wird durch Pyrimidin ersetzt und umgekehrt     Entstehung von falschen Basenpaarungen Basen können in verschiedenen Strukturisomeren vorliegen normalerweise liegt die stabilste Form vor liegt aber ausnahmsweise ein anderes Isomer vor (Enolform), kann es zu ungewöhnlichen Basenpaarungen kommen ohne Reparatur entsteht bei der nächsten Replikationsrunde eine Punktmutation    
• Folgen eines Basenaustauschs   stille Mutation: keine Auswirkung neutrale Mutation: Bildung einer anderen, aber chemisch verwandten Aminosäure → keine / geringfügige Veränderung des Proteins missense-Mutation: Bildung einer anderen, chemisch nicht verwandten Aminosäure → Veränderung / Verlust der Proteinfunktion nonsense-Mutation: Bildung eines Stopcodons → Abbruch der Translation → Bildung eines verkürzten, meist funktionslosen Proteins  
• Punktmutation durch Insertion oder Deletion von Basen   Insertion → Einfügen eines Nukleotids Deletion → Verlust eines Nukleotids Entstehung:   „Ausrutschen“ der Polymerase und Abfall von der DNA → die Synthese wird an einem fehlgepaarten Substrat wieder aufgenommen Loop im Matrizenstrang führt zu Deletionen Loop im neuen Strang führt zu Insertionen   Kommen besonders häufig bei Sequenzwiederholungen vor (Mikrosatelliten).      
• Konsequenzen von Insertionen und Deletionen   Im offenen Leserahmen entstehen Rasterschubmutationen (s.u.) sofern die Anzahl der eingefügten / weggelassenen Basen nicht durch 3 teilbar ist → dramatische Konsequenzen für das Genprodukt   Bei Insertion / Deletion von 3 Basen (oder Vielfachen von 3) werden Aminosäuren hinzugefügt oder beseitigt → Ursache für verschiedene Erbkrankheiten (fragile-X-Syndrom, Chorea Huntington)   I
• Punktmutation durch spontane Depurinierung = Verlust der Purinbase in einem Nukleotid   → durch spontane Hydrolyse der N-glykosidischen Bindung zwischen Zucker und Base → am häufigsten bei Guanin, da die N-glykosidische Bindung wärmelabil ist → es bilden sich „AP-Sites“ (apurinische Stellen) → in der nächsten Replikationsrunde kommt es zum Abbruch der Replikation oder zum Einbau eines falschen Nukleotids  
• Punktmutation durch spontane Desaminierung = Umwandlung einer Amonogruppe in eine Ketogruppe   → Umwandlung einer Aminogruppe zur Ketogruppe → wird häufig ausgelöst durch Nitrat- oder Nitritionen → Desaminierung von Cytosin führt zur Bildung von Uracil → Uracil ist kein normaler DNA-Bestandteil, daher wird der Fehler i.d.R. erkannt und repariert → Desaminierung von 5-Methyl-Cytosin ist problematischer, denn es entsteht Thymin → man kann nicht erkennen, welches die falsche Base im Doppelstrang ist  
• Punktmutation durch oxidative Zerstörung   → durch Sauerstoffradikale, Hydroxylradikale, Wasserstoffperoxid → entstehen durch den aeroben Stoffwechsel (oxidativer Stress) vor allem durch Hydroxylradikale kommt es zu einer Oxidation der Basen besonders häufig entsteht 8-Oxoguanin bei der Replikation wird dann Adenin als komplementäre Base eingebaut und nicht Cytosin  
• Übersicht über mutagene Stoffe alkylierende Agenzien depurinierende Agenzien interkalierende Agenzien Agenzien zum Einbau von Basenanaloga UV-Strahlung ionisierende Strahlung
• Alkylierende Agenzien   Alkylierende Chemikalien führen zu einer Methylierung (= Anhängen einer CH3-Gruppe) oder Ethylierung (= Anhängen einer CH2-CH3-Gruppe) an verschiedenen Positionen von Nukleotiden.   Es kommt dann zu Veränderung der chemischen Eigenschaften mit der Folge: Fehlpaarung der alkylierten Basen Entstehung von AP-Stellen (Ausfall einer Base)   O6-MeG (O6-Desoxymethylguanidin) → ähnelt strukturell Adenin → kann mit Thymin paaren und wird dabei nicht erkannt → hoch mutagen N7-MeG (N7-Desoxymethylguanidin) → führt zum Ausfall einer Base → kann durch die Basen-Exzisionsreparatur korrekt repariert werden und ist daher nicht ganz so schlimm   Beispiele für Alkylanzien: Ethylmethansulfonat Nitrosoguanidin  
• Interkalierende Agenzien   täuschen ein ganzes Basenpaar vor können sich selbst zwischen die Basenpaare der Doppelhelix schieben Folge: Insertionen, Deletionen einzelner Basenpaare bei der nächsten Replikation   Beispiele: Proflavin Acridine orange  
• Agenzien zum Einbau von Basenanaloga   die chemische Struktur der Agenzien ist denen von Nukleotiden sehr ähnlich Agenzien werden bei der Replikation statt einem Nukleotid eingebaut haben andere Paarungseigenschaften als die Basen → bei der nächsten Replikationsrunde kommt es zum Austausch eines Basenpaars z.B. Bromdesoxyuridin
• UV-Schäden der DNA   → führen zur Entstehung von Pyrimidindimeren DNA hat bei einer Strahlung mit der Wellenlänge von ca. 260 nm das Absorptionsmaximum. Bei energiereicherem Licht kommt es zu einem Energieüberschuss, der zur Bildung von Cyclobutandimeren oder von 6,4-Photoprodukten verwendet wird   Cyclobutandimere stellen Quervernetzungen benachbarter Basen durch einen Cyclobutanring dar die Helixstruktur der DNA wird dadurch gestört (Bildung von bulky lesions) DNA-Polymerase kann nicht erkennen, um welche Base es sich handelt und setzt pro forma Adenin als Komplementärbase ein   CAVE: E.coli besitzt Photolyase zur Auflösung von Dimeren  
• DNA-Schäden durch ionisierende Strahlung indirekter Schaden durch Entstehung freier Radikale, die dann mit der DNA reagieren bei starker Einwirkung Einzel-oder Doppelstrangbrüche Zerstörung oder Veränderung von Basen
• Ames - Test für mutagene Stoffe   Verwendung von Salmonella typhimurium: äußere Membran ist sehr durchlässig für Chemikalien Zellen haben einen Reparaturdefekt Verwendung von Stämmen, die bzgl. einer Komponente auxotroph sind, z.B. his-   Vorgehensweise: Plattierung auf einem Mangelmedium → Mutationen zu his+ werden sichtbar in die Mitte des Mediums wird auf einem Filter ein Mutagen gegeben → Beobachtung der Zunahme der Mutationen bei verschiedenen Konzentrationen des Agens ab einer bestimmten Konzentration des Agens wachsen gar keine Bakterien mehr in der Umgebung des Filters → die DNA wurde zu stark geschädigt und die Bakterien sterben ab    
• Warum greifen Antibiotika am Ribosom an?   Viele Antibiotika greifen am Ribosom an, denn Ribosomen sind sehr konserviert, d.h. überall nahezu gleich gebaut Ribosomen sind sehr optimiert, d.h. Mutationen setzen sich nur sehr schwer durch  
• Wirkweise von Streptomycin   Auch Streptomycin ist ein Antibiotikum, das die Proteinbiosynthese blockiert → dadurch wird das Bakterienwachstum gehemmt Streptomycin lagert sich irreversibel an die kleine Untereinheit der Ribosomen an es kommt zum Zusammenbruch der Polysomen und zur Akkumulation von Streptomycin-gebundenen Monosomen   Folgen: → Hemmung des Translationsgbeginns → Fehlablesungen der mRNA → Verlangsamung der Translation dadurch entstehen Proteine mit falschen Aminosäuren und verkürzte Proteine Folgen: → Enzyme sind funktionsunfähig → ungeeignete Strukturproteine → Veränderungen in der Permeabilität der Zellwand → Störungen in der Zellatmung → Tod der Bakterienzelle    
• Minimale Hemmkonzentration = Konzentration eines Antibiotikums, oberhalb derer sich nur resistente Bakterien durchsetzen können
• Additive Polygenie   Resistente Bakterien haben somit eine höhere minimale Hemmkonzentration als der Ausgangsstamm und können wiederum Mutanten hervorbringen, deren minimale Hemmkonzentration noch höher liegt usw. → = additive Polygenie (unabhängige Mutationen haben einen additiven Effekt in Bezug auf ein bestimmtes Merkmal)  
• Resistenzmechanismen von Bakterien gegenüber Antibiotika   Mutation in der 30S-Untereinheit des Ribosoms Methylase verhindert die Bindung von Streptomycin an die 30S-Untereinheit Hemmung des Transports von Streptomycin durch die Membran in die Zelle / aktiver Transport von Streptomycin aus der Zelle plasmidvermittelte Resistenz: Plasmide tragen Gene für Enzyme, die Streptomycin modifizieren → z.B. Acetylierung der primären Aminogruppen → z.B. Phosphorylierung der Hydroxylgruppen  
• Versuch zur Identifikation von streptomycin-resistenten Bakterien   Arbeit mit einer streptomycinhaltigen Schrägagarplatte: Platte weist an unterschiedlichen Stellen unterschiedliche Konzentrationen von Streptomycin auf → dünnste Stelle: 0 µg/ml → dickste Stelle: 25 µg/ml → Beginn des Agarkeils markieren → Pfeil von der dünnsten zur dicksten Stelle des Keils zeichnen   über den Agarkeil wird normaler LB-Agar gegossen und gleichmäßig verteilt → Streptomycin diffundiert in die oberen Agarschichten   E.coli werden auf den Agar plattiert und über nach inkubiert (37°C)   am nächsten Tag kann die Grenze des geschlossenen Bakterienrasens markiert werden   über den Dreisatz kann die minimale Hemmkonzentration bestimmt werden: → Strecke des gesamten Keilagars = 25 µg Strecke bis zur Wachstumsgrenze = x   jenseits der Grenze können spontanresistente Mutantenkolonien ausgezählt werden; auch hier kann über den Dreisatz berechnet werden, bei welcher Konzentration die Kolonien wachsen  
• Versuch zur additiven Polygenie   hier arbeitet man ebenfalls mit einer streptomycinhaltigen Agarplatte, die mit normalem Agar übergossen wurde   mit einer Impföse wird eine resistente Kolonie von der Platte aus dem vorherigen Versuch entnommen → wichtig: es muss zuvor ermittelt werden, bei welcher Streptomycinkonzentration die Kolonie gewachsen ist → Bakterien werden in Saline suspendiert → Bakterien werden auf die neue Platte plattiert Platte wird über Nacht inkubiert (37°C)   am nächsten Tag wird wiederum die Grenze des geschlossenen Bakterienrasens markiert und erneut die neue minimale Hemmkonzentration ermittelt, sowie spontanresistente Kolonien ausgezählt  
• Prototrophie und Auxotrophie   Prototrophie: Prototrophe Mikroorganismen brauchen neben Glucose keine weiteren organischen Komponenten im Wachstumsmedium, sondern nur anorganische Komponenten → sie besitzen die genetischen Informationen zur Synthese aller notwendigen Verbindungen (z.B. Aminosäuren, Vitamine...) → man spricht von einem Minimalmedium / synthetisches Medium   Auxotrophie: Auxotrophen Mikroorganismen fehlt die Fähigkeit zur Synthese einer oder mehrerer der notwendigen Komponenten → sie können nur wachsen, wenn das Wachstumsmedium die entsprechende Substanz enthält → man braucht ein komplementiertes Minimalmedium oder ein Vollmedium (LB-Medium)  
• Versuch zur Isolierung von auxotrophen Mutanten   Die Identifikation kann nur indirekt erfolgen: Mutanten wachsen auf Medien mit Wuchsstoffen, nicht aber auf einem Minimalmedium → Identifikation erfolgt über die Replikaplattierung   eine Platte mit einer überschaubaren Anzahl an Kolonien, die schön verteilt liegen, wird aus dem vorherigen Versuch ausgewählt auf einem Stempel wird ein steriles Samttuch fixiert die ausgewählte Platte wird leicht auf den Stempel aufgedrückt; so werden die Kolonien auf den Samt übertragen durch Aufdrücken können die Kolonien auf eine M9-Minimalmediumplatte und auf eine neue LB-Vollmediumplatte übertragen werden Platten werden über Nacht inkubiert (37°C) am nächsten Tag kann die Anzahl der Kolonien auf den einzelnen Platten bestimmt werden → prototrophe Kolonien: finden sich sowohl auf der M9, als auch auf der LB und der Originalplatte → auxotrophe Kolonien finden sich nicht auf der M9, sondern nur auf der LB und der Originalplatte  
• Versuch zur Charakterisierung von auxotrophen Mutanten   eine auxotrophe Kolonie wird von der LB-Platte mit einer Impföse entnommen und in Saline suspendiert ein Teil der Suspension wird auf eine M9-Minimalmediumplatte plattiert auf die Platte werden Filterscheiben aufgelegt, die mit je einer bestimmten Aminosäure getränkt sind (insgesamt 6 verschiedene) Platten werden über Nacht inkubiert am nächsten Tag kann festgestellt werden, um welche Filterscheiben Bakterienwachstum stattgefunden hat → dadurch kann man sehen, für welche Substanz die Bakterien auxotroph sind                  

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