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Genetik (Subject) / Genetik Mündlich (Lesson)

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• Versuch zur 1. Transformation → Griffith   Arbeit mit Bakterienstämmen von Pneumococcus pneumoniae: S-Stamm: von Polysaccharidkapsel umgeben, virulent → führen bei Mäusen zum Tod R-Stamm: ohne Kapsel, avirulent → infizierte Mäuse überleben   Ablauf des Versuchs Injektion von S-Stamm in Mäuse → Mäuse sterben → S-Stamm kann aus dem Blut isoliert werden Injektion von R-Stamm in Mäuse → Mäuse überleben → es können keine Bakterien aus dem Blut isoliert werden   Injektion von durch Hitze abgetöteten S-Stamm in Mäuse → Mäuse überleben → es können keine Bakterien aus dem Blut isoliert werden   Injektion von durch Hitze abgetöteten S-Stamm und lebenden R-Stamm in Mäuse → Mäuse sterben → Bakterien mit einem S-Phänotyp werden aus dem Blut isoliert   Schlussfolgerung Etwas aus den toten S-Stamm muss in die lebenden R-Stamm übergegangen sein. → Griffith nannte den Prozess des Übergangs Transformation → Griffith nannte das übergehende etwas das „transformierende Prinzip“  
• Definition Transformation   Transformation = Aufnahme von genetischem Material direkt aus dem umgebenden Medium  
• Versuch zur Identifikation des genetischen Materials   → Avery, McLeod, McCarty Die Forscher setzten die Arbeit mit P. pneumoniae fort und wollten herausfinden, was das „transformierende Prinzip“ war: aus dem Zellextrakt des S-Stamms wurden nacheinander die Hauptbestandteile entfernt und man beobachtete, was dann unter Anwesenheit der lebenden R-Stamm-Bakterien passierte:   R-Stamm + S-Stamm (tot)   Transformation R-Stamm + S-Stamm (tot) + RNAse RNA wird zerstört Transformation R-Stamm + S-Stamm (tot) + Protease Proteine werden zerstört Transformation ... ... ... R-Stamm + S-Stamm (tot) + DNAse DNA wird zerstört Keine Transformation   → Das genetische Material ist das transformierende Prinzip!  
• Vermehrungszyklus eines Phagen   Phage heftet sich an die OF einer Wirtszelle an Injektion von Phagen-DNA in die Wirtszelle Bildung von Phagenenzymen → Auflösung der Bakterien-DNA → Bildung von Phagenbestandteilen (DNA, Kopfkapseln, Schwanzfäden...) Zusammensetzung neuer Phagen aus den Einzelkomponenten Lyse der Wirtszelle, Freisetzung der Phagen
• Hershey-Case-Experiment   T2-Phagen wurden mit radioaktiven Stoffen markiert: Gruppe 1: Markierung mit 32 P → markiert die Phagen-DNA radioaktiv Gruppe 2: Markierung mit 35 S → markiert die Proteinhülle der Phagen radioaktiv   E.coli wurden mit jeweils einer Gruppe der markierten Phagen infiziert und nach einiger Zeit wurden die leeren Phagenhüllen isoliert.   Beobachtung: E.coli + Phagen Gruppe 1: Bakterienzellen waren radioaktiv markiert E.coli + Phagen Gruppe 2: Bakterienzellen waren nicht radioaktiv markiert   Fazit: Phagen-DNA wird in die Wirtszelle injiziert und dort vervielfältigt!  
• Grobe Übersicht über den Aufbau der DNA   Grundeinheiten der DNA: Nukleotide mehrere Nukleotide bilden einen Strang → Verbindung durch Phosphodiesterbindungen 2 komplementäre Stränge bilden eine Doppelhelix Doppelhelix und Gerüstproteine bilden eine dreidimensionale Struktur  
• Bestandteile eines Nukleotids   Nukleotid = Stickstoffbase + Pentosezucker + Phosphatrest  
• Stickstoffbasen Purinbasen Adenin Guanin Pyrimidinbasen Cytosin Thymin Uracil
• Bildung eines Nukleotids   Ausgangsprodukte: Phosphorsäure Pentosezucker (Ribose oder Desoxyribose) Base   Der Phosphatrest wird meistens ans C5-Atom des Zuckers gebunden. Die Base wird immer ans C1-Atom des Zuckers gebunden. Insgesamt werden dabei 2 Moleküle H2O abgespalten.  
• Nomenklatur von Nukleotiden   Nukleosid = Pentosezucker + Stickstoffbase Nukleotid = Pentosezucker + Stickstoffbase + Phosphatrest Nukleotide können mehrere Phosphatreste tragen: Nukleotide mit einem Phosphatrest = Nukleosidmonophosphat (NMP) Nukleotide mit zwei Phosphatresten = Nukleosiddiphosphat (NDP) Nukleotide mit drei Phosphatresten = Nukleosidtriphosphat (NTP)  
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• Tabelle Nomenklatur Nukleoside und Nukleotide   Base Nukleosid mit Ribose Nucleosid mit Desoxyribose Nukleotid Adenin Adenosin 2-Desoxyadenosin (2-Desoxy)- Adenosin-5-Phosphat Thymin - 2-Desoxythymidin 2-Desoxy- Thymnisin-5-Phosphat Guanin Guanosin 2-Desoxyguanosin (2-Desoxy)- Guanosin-5-Phosphat Cytosin Cytidin 2-Desoxycytidin (2-Desoxy)- Cytidin-5-Phosphat Uracil Uridin - Uridin-5-Phosphat
• Bildung eines Nukleotidstrangs   Die Nukleotide werden durch eine 3'5' Phosphodiesterbindung miteinander verknüpft, d.h. die Bindung entsteht zwischen Phosphatgruppe, die sich am C5 Atom der Pentose des einen Nukleotids befindet OH-Gruppe, die sich am C3 Atom der Pentose des anderen Nukleotids befindet   Die „Vorläufermoleküle“ sind Nukleosidtriphosphate. Bei der Kettenbildung werden 2 Phosphate (Pyrophosphat) abgespalten.   Dadurch entsteht eine Kette, die 2 unterschiedliche Enden aufweist: 3' Ende: bezieht sich auf die OH-Gruppe am C3-Atom des Pentosezuckers 5' Ende: bezieht sich auf den Phosphatrest am C5-Atom des Pentosezuckers  
• Basenpaarungen in der DNA   Immer 2 Basen sind komplementär zueinander und über Wasserstoffbrücken-bindungen miteinander verknüpft:   Adenin + Thymin (2 Wasserstoffbrückenbindungen) Adenin + Uracil (2 Wasserstoffbrückenbindungen)   Guanin + Cytosin (3 Wasserstoffbrückenbindungen)  
• Aufbau des DNA-Doppelstrangs   DNA setzt sich aus 2 Nukleotidsträngen zusammen, die um eine zentrale Achse gewunden sind an der Außenseite befindet sich das „Phosphat-Desoxyribose-Rückgrat“ Basen befinden sich auf der Innenseite der Doppelhelix und sind senkrecht zur Achse ausgerichtet komplementäre Basenpaarungen (s.o.) Stränge verlaufen antiparallel → wegen des unterschiedlichen Bindungswinkel der Nukleotidbestandteile könnte sonst keine stabile Doppelhelix entstehen große und kleine Furche zur Bindung von Proteinen  
• Gründe für die Stabilität der DNA   Gesamtheit der Wasserstoffbrückenbindungen → einzelne Bindungen sind zwar schwach, aber die Gesamtheit ist deutlich stabiler antiparallele Laufrichtung der Stränge Anordnung der Nukleotidbestandteile → Phosphat-Desoxyribose-Rückgrat ist außen, negativ geladen und hydrophil: kann Wechselwirkungen mit Wasser eingehen → Basen sind innen, hydrophob und vom Wasser abgeschirmt  
• Konformationen der DNA   Die physiologisch vorliegende Konformation ist die B-DNA → zu finden in wässrigem Medium mit geringem Salzgehalt.   Darüber hinaus gibt es noch: A-DNA: kompakter als B-DNA → in dehydratisiertem Medium → in stark salzhaltigem Medium   Z-DNA: linksgängige Doppelhelix mit Sequenzen aus C-G-Paarungen → Zick-Zack-Form → hat evtl. regulatorische Funktion  
• Vergleich von eukaryotischem und prokaryotischem Genom   Prokaryotisches Genom Eukaryotisches Genom 1 einziges Chromosom ringförmig in direktem Kontakt zum Cytoplasma mehrere Chromosomen linear im Zellkern   manchmal auch mehrere Chromosomen- sätze (Polyploidie)   größere DNA-Menge (teilweise) Plasmide: ringförmige, extrachromosomale DNA-Sequenzen → replizieren unabhängig von der DNA → kodieren Eigenschaften, die unter bestimmten Bedingungen von Vorteil sind Mitochondriale DNA Chloroplasten DNA   → ringförmig
• Linking number   → gibt die Anzahl an vollständigen Windungen in einem DNA-Molekül an   Beispiel: E.coli hat 2100 Basenpaare → 10,5 Basenpaare pro Windung → 200 Windungen → Lk = 200   Durch positive Überdrehungen (Supercoils) kann die Lk erhöht werden. → sind rechtsgewunden   Durch negative Überdrehungen (Supercoils) kann die Lk herabgesetzt werden. → sind linksgewunden → Einsatz beim partiellen Aufschmelzen der DNA  
• Topoisomere   Moleküle, die eine unterschiedliche Lk aufweisen, aber ansonsten identisch sind
• Nachweis von Supercoils   → Agarosegelelektrophorese Überspiralisierte DNA wandert schneller als relaxierte DNA:  
• Topoisomerasen   = Enzyme, die die Lk erhöhen oder herabsetzen   Topoisomerase Typ I → führt einen Einzelstrangbruch herbei → verändert die Lk in Schritten von +/- 1 → meistens wirkt sie entspannend Topoisomerase Typ II → führt einen Doppelstrangbruch herbei → verändert die Lk in Schritten von +/- 2   Gyrase = Sonderform bei E.coli → entwindet die DNA unter ATP-Verbrauch und erzeugt so einen negativen Supertwist
• Wichtige Regionen auf eukaryotischen Chromosomen     Telomer = Chromosomenende mehrere Origins of replication Centromer = Spindelfaseransatzstelle Gene befinden sich zwischen Telomeren und Centromeren  
• Unterschiede im Genom von höheren und niederen Eukaryoten   Höhere Eukaryoten (z.B. Pflanzen, Säuger) lange Gene viele Introns   Niedere Eukaryoten (z.B. Hefe) kurze Gene wenig Introns  
• Repetetive Sequenzen   = DNA-Sequenzen, die in zahlreichen Wiederholungen im Genom vorkommen entweder über das gesamte Genom verteilt oder tandemartig hintereinander geschalten   Man kann unterscheiden: Hoch repetetive Sequenzen = Satelliten-DNA 104 bis 106 Wiederholungen pro Genom Sequenz selbst ist aber relativ kurz (max. einige hundert Basenpaare) in linearer Anordnung: in Centromer- und Telomerregion im Genom verteilt: SINES, Alu-Element   Moderat repetetive Sequenzen 100 bis 1000 Wiederholungen pro Genom in linearer Anordnung: Gene für rRNA, Gene für Histone im Genom verteilt: Origins of replication, LINES   Nicht repetetive Sequenzen ein bis wenige Wiederholungen pro Genom z.B. Gene  
• Aufbau des Chromatinfadens   Nukleosom = DNA Doppelstrang, der um ein Histonprotein gewunden ist umfasst 146 Basenpaare entspricht 1,75 Windungen   Linker-Region = Verbindung zwischen 2 Nukleosomen umfasst 160 – 200 Basenpaare  
• Histonproteine   basisch positiv geladen (viel Lysin und Arginin) können daher an die negativ geladenen Phosphatreste der DNA binden   Man unterscheidet: H1: leitet die linker-Region ein ermöglicht eine stärkere Komprimierung (Faktor 40 bis 50) sehr reich an Lysin   Alle weiteren Histone werden vom DNA-Strang umwickelt: H2A: leicht mit Lysin angereichert H2B: leicht mit Lysin angereichert H3: reich an Arginin H4: reich an Arginin → lagern sich zu Dimeren zusammen → es handelt sich um sog. „core-Histone“, die während der Evolution streng konserviert wurden  
• Strukturebenen eukayrotischer Chromosomen   Primärstruktur Chromatinfaden (Durchmesser 11 nm) Sekundärstruktur Solenoidstruktur (mehrere Nukleosomen liegen eng zusammen spiralisiert vor; Gerüstproteine zur Stabilisierung) Tertiärstruktur Schleifendomänen: Solenoidstruktur bildet Schleifen, welche an einem Gerüst aus Nicht-Histonproteinen (Kernmatrix) verankert sind → DNA-Abschnitte, die mit dem Gerüst in Kontakt stehen: MARS = matrix associated regions SARS = scaffold associated regions
• Semikonservativer Replikationsmechanismus   Watson & Crick schlagen aufgrund der Struktur der DNA einen Mechanismus der Replikation vor, bei dem sich der Doppelstrang in die Einzelstränge aufteilt und jeder Einzelstrang als Matrize für die Bildung eines komplementären Stranges dient. Tatsächlich liegt ein semikonservativer Mechanismus der Replikation vor: der Doppelstrang spaltet sich in zwei Einzelstränge auf jeder Einzelstrang dient als Matrize für die Bildung eines neuen, komplementären Stranges   → die neu entstehenden Doppelstränge bestehen also je aus einem alten und einem neuen Einzelstrang  
• Beweis der semikonservativen Replikation   Meselson-Stahl-Experiment: E. Coli wuchsen in einem Nährmedium mit einem schweren Stickstoffisotop. Nach einiger Zeit enthielten alle Basen der Zellkolonie das schwere Isotop → DNA ist schwer Bakterien wurden nun für genau eine Generation in ein Medium mit leichtem Stickstoff gebracht → DNA ist vom Gewicht her zwischen schwerer und leichter DNA Nach einer weiteren Generation im leichten Medium konnte man mittelschwere und leichte DNA nachweisen  
• Alternative Replikationsmechanismen   Konservativer Replikationsmechanismus der Doppelstrang spaltet sich in die Einzelstränge auf und jeder Strang dient als Matrize für einen Komplementärstrang anschließend setzen sich aber die Matritzenstränge wieder zusammen und die neu gebildeten Stränge setzen sich zu einem Doppelstrang zusammen   Disperser Replikationsmechanismus der elterliche Doppelstrang wird beim Entspiralisieren durch Enzyme getrennt und es entstehen zerstückelte Einzelstränge Bruchstücke werden komplementär ergänzt Bruchstücke setzen sich zu einem Doppelstrang zusammen  
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• Übersicht über die Hauptphasen der Replikation   Initiation: Beginn der Replikation am Origin of Replication Elongation: bidirektionales Voranschreiten der DNA-Synthese Termination: Beenden der Replikation  
• Aufbau des OriC   Der OriC hat 3 wichtige Bereiche für den Beginn der Replikation: AT-reiche Regionen (lassen sich wegen nur 2 vorhandenen Wasserstoffbrückenbindungen leichter aufschmelzen) DnaA-Boxen GATC-Methylierungsstellen → werden methyliert
• Erste Schritte der Replikation bei E.coli   Den ersten Schritt der Replikation bildet dann das Initiatiorprotein DnaA: Es bindet an spezielle Bindungsstellen (DnaA-Boxen) am OriC   mehrere Initiatorproteine binden an DnaA-Boxen und bilden einen Komplex, um den sich die DNA windet dadurch Trennung der AT-Basenpaarungen durch das Hilfsprotein HU hier kann nun Helikase ansetzen (s.u.)  
• Entwindung und Öffnung der DNA bei der Replikation   Damit es zur Replikation kommen kann, müssen die Wasserstoffbrückenbindungen zwischen komplementären Basenpaaren aufgeschmolzen werden → durch das Enzym Helicase (DnaB) → Helikase liegt in einem Komplex mit einem Hilfsprotein vor (DnaC), das hilft die Helicase auf die Stränge zu verladen und dann abdissoziiert → unter ATP-Verbrauch → der aufgespreizte Bereich wird als Replikationsgabel bezeichnet   Helikase entwindet die Stränge in 2 Richtungen, daher bilden sich 2 Replikationgabeln (bidirektionale Replikation)!   Damit sich die Einzelstränge nicht wieder zusammenlagern, werden an die Enden Proteine angelagert: SSB (single strand bindende Proteine)   Bei Bakterien: Vor der Replikationsgabel entsteht ein positiver Supertwist → die Überspiralisierungen werden durch das Enzym Gyrase gelöst Aufschneiden der DNA Rückgängigmachen der Drehungen erneute Verknüpfung der Stränge  
• Definition und Aufbau Primer   Damit die Replikation durch die DNA-Polymerase beginnen kann (s.u.), muss ein bestimmter Anfangsstrang vorhanden sein, an den die Polymerase weitere Enzyme anhängt: der Primer   RNA-Abschnitt 15-20 Nukleotide lang komplementär zum entsprechenden Abschnitt der DNA wird gebildet durch das Enzym Primase (DnaG) → dabei handelt es sich um eine RNA-Polymerase   Später muss der Primer wieder entfernt werden und durch ein entsprechendes Stück DNA ersetzt werden → Aufgabe der DNA-Polymerase I (s.u.)
• Aufgaben der DNA-Polymerase   Polymerasefunktion: Verknüpfung von Nukleotiden zu längeren Ketten → dadurch Synthese des komplementären Strangs (siehe voheriges Kapitel) → in 5' zu 3' Richtung (Nukleotide werden ans 3' Ende angehängt)   Exonukleasefunktion: Abbau von DNA durch Abspaltung von einzelnen Nukleotiden → Korrekturfunktion → in 3' zu 5' Richtung (Nukleotide werden ans 5' Ende angehängt) → oder 3' zu 5' Richtung (proofreading, siehe später)  
• Voraussetzung für die Arbeit von DNA-Polymerase   Vorhandensein aller 4 Nukleotide Vorhandensein von Matrizen-DNA Vorhandensein eines 3' Endes  
• Arten von DNA-Polymerase bei Bakterien   DNA-Polymerase I besteht aus einer Untereinheit übernimmt hptsl. Reparaturarbeiten (Exonukleasefunktion und Proofreading) aber auch Polymerasefunktion Ersetzung des Primers   DNA-Polymerase II Polymerasefunktion Proofreading-Funktion   DNA-Polymerase III führt die eigentliche Replikation durch → Polymerasefunktion Proofreading-Funktion  
• Aufbau von DNA-Polymerase III   DNA-Polymerase III ist ein Holoenzym: Verbindung des Proteinanteils eines Enzyms mit einem Cofaktor, der selbst kein Protein ist (hier: Magnesium) Es handelt sich um ein Dimer mit 10 verschiedenen Untereinheiten: 3 Untereinheiten bilden das Kernenzym, das für die eigentliche Polymeraseaktivität zuständig ist 5 Untereinheiten bilden einen gamma-Komplex zum Aufladen des Enzyms auf die Matrize ß-Untereinheit bildet eine Klammer, damit das Enzym nicht von der Matrize fällt 1 Untereinheit zur Dimerisation von 2 Kernenzymen (damit beide DNA-Stränge gleichzeitig ergänzt werden können)  
• Was versteht man unter bidirektionaler DNA-Synthese?   Bei der Replikation werden beide Matrizenstränge gleichzeitig ergänzt.   ABER: Polymerase arbeitet nur in 5' zu 3' Richtung und nur ein Matrizenstrang hat ein freies 3' Ende → Nur ein Strang kann kontinuierlich ergänzt werden (Leitstrang, leading strand)   → Der andere Strang muss abschnittweise diskontinuierlich ergänzt werden (Folgestrang, lagging strand) → Dabei entstehende Fragmente = Okazaki-Fragmente → die Verbindung der einzelnen Fragmente erfolgt durch das Enzym Ligase (unter ATP-Verbrauch)  
• Was ist das Primosom?   = Initiationskomplex für den Folgestrang → läuft im Folgestrang der DNA-Polymerase voraus und bildet die Primer für die Okazaki-Fragmente  
• Was ist das Replisom?   = Elongationskomplex, bestehend aus DNA-Polymerase III clamploader und clamps Helikase Primasen am Folgestrang   Durch das Replisom werden beide Replikationsgabeln koordiniert!  
• Genauigkeit der Replikation   ohne Korrekturfunktion: 1 Fehler alle 104 – 105 Nukleotide mit Proofreading: 1 Fehler alle 106 – 107 Nukleotide mit mismatch-Reparatur ( = Postreplikationsreparatur): 1 Fehler alle 109 – 1010 Nukleotide  
• Replikon   = Replikationseinheit, die durch einen Origin of Replication koordiniert wird → bei Prokaryoten ist das ganze Chromosom ein Replikon, da sie nur einen oriC besitzen!  
• Termination der Replikation bei Prokaryoten   Irgendwann nähern sich die beiden Replikationsgabeln auf dem Ringchromosom einander an. Links und rechts vom theoretischen Treffpunkt finden sich die Terminationssequenzen T1 und T2.   T1 besteht aus ter D und ter A T2 besteht aus ter C und ter B   Das Terminationsprotein tus (terminus utilisation substance) bindet an die Terminationssequenzen. Helikase wird dadurch an einer weiteren Entwindung der DNA gehindert.  
• Catenate   = ineinander verkettete DNA-Ringe am Ende der Replikation → eine Verteilung auf die Tochterzellen ist so nicht möglich → Trennung durch Topoisomerase II  
• Eukaryotischer Zellzyklus   Interphase: Neubildung der Zweichromatidchromosomen → G1-Phase → S-Phase → G2-Phase   Mitose: Verteilung der Chromosomen  
• Phasen der Mitose   Prophase Chromosomen verkürzen sich Ausbildung eines Spindelfaserapparats Kernmembran und Kernkörperchen lösen sich auf   Metaphase Chromosomen sind maximal verkürzt Chromosomen ordnen sich in der Äquatorialebene des Spindelfaserapparats nebeneinander an Verbindung der Chromosomen mit beiden Spindelpolen   Anaphase Centromere der Chromosomen teilen sich Einchromatidchromosmen bewegen sich zu entgegengesetzten Spindelpolen   Telophase Entspiralisierung der Einchromatidchromosomen Spindelapparat löst sich auf Neubildung von Kernmembran und Nukleolus um jeden Chromosomensatz   Es schließt sich die Cytokinese an, in der die Zelle geteilt wird.  
• Replikons bei Eukaryoten   Auf jedem Chromosom gibt es mehrere Replikationsursprünge und daher auch mehrere Replikons Replikons werden nicht gleichzeitig repliziert, sondern nach einem bestimmten zeitlichen Muster durch die bidirektionale Synthese bilden sich Replikationsblasen, die später miteinander verschmelzen    
• DNA-Polymerasen bei Eukaryoten   alpha-Polymerase → bildet den Primer (Primasefunktion) beta-Polymerase → hptsl. Reparatur gamma-Polymerase → in Plastiden und Mitochondrien delta-Polymerase → Replikation des Folgestrangs → Reparaturfunktion epsylon-Polymerase → Replikation des Leitstrangs → Reparaturfunktion   Alle Polymerasen außer der ß-Polymerase bestehen aus mehreren Untereinheiten  

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