ABT (Subject) / Techniken und deren Anwendung II (Lesson)

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• Allgemeine Fakten zur in vitro Vermehrung vegetative Erzeugung genetisch identischer Nachkommen Induktion der Sprossbildung (durch Aufheben der Apikaldominanz) hat in den letzten 30-40Jahren große wirtschaftliche Bedeutung erlangt
• Wo wird in vitro Vermehrung angewendet, nenne je ein Beispiel Zierpflanzen: Orchideen Nutzpflanzen: Kartoffel Forstwirtschaft: Banane
• Welche Voraussetzung muss eine Pflanzenzelle für die in vitro Vermehrung haben? Sie muss Totipotent sein (alle Entwicklungsmöglichkeiten offen)  
• Was muss dem Nährmedium in der Petrischale bei Meristemvermehrung hinzugegeben werden? Phytohormone (Auxine, Cytokinine)
• Beschreibe kurz ein Kulturverfahren zur schnellen Vermehrung von Pflanzen Meristemvermehrung Entfernung der Sprossspitze (-> Aufhebung der Apikaldominanz) Zerteilung eines intakten Sprosses in einzelne Nodien mit Achselknospen (=Seitenknospen) Kultivierung der Nodien mit Nährlösung + Phytohormonen Entwicklung neuer Pflanzen (die genetisch vollkommen identisch mit der Ausgangspflanze sind = Klone)
• Was bewirkt eine hohe Auxinkonzentration (Phytohormon, das Nähemedium hinzugegeben wird) induziert starke Zellproliferation führt zu losem Zellhaufen mit großen stark vakuolisierten Zellen (Kallus)           -> aus diesen können Suspensionskulturen erhalten werden
• Nennen Sie wichtige Punkte zu Kalli- und Suspensionskulturen werden gewonnen aus losem Zellhaufen (entstanden durch hohe Auxinkonzentration von Pflanzen) können sich auf geeignetem Nährboden wieder zur vollständigen Pflanze entwickeln üblicherweise werden die verwendet, die direkt nach der Überführung in das Nährmedium gebildet werden
• Was kann anstelle von ganzen Pflanzenzellen noch als Zellkultur verwendet werden? Protoplasten (Zellen ohne Zellwand)
• Beschreiben Sie kurz die Herstellung von Protoplasten aus sterilen pflanzlichen Geweben (Blätter, Sprosssegmente, Einzelzellen) Zellwandlose Einzelzellen können z.B. fusioniert oder transfomiert werden nach Regenerierung ihrer Zellwand können sie auf Medium zur Kallusbildung angeregt werden oder in Flüssigkeitsmedium als Suspensionskultur von Einzelzellen vermehrt werden
• Was versteht man unter somaklonaler Variation? Veränderungen von Eigenschaften, die bei der in vitro Vermehrung von zellen, Kalli oder Organen auftreten Vergleich von über Organogenese entstandenen Nachkommen mit solchen aus somatischen Embryonen (starke phänotypische Variabilität bei Nachkommen aus somatischen Embryonen = somaklonale Veränderung)
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• Wodurch sind somaklonale Variationen bedingt? zahlreiche Faktoren u.a. Stress spontane Mutationsrate des Ausgangsmaterials
• Wann ist somaklonale Variation gewünscht? In der Pflanzenzüchtung wird sie seit langem als Züchtungsmethode genutzt NICHT erwünscht bei Erzeugung von transgenen Pflanzen
• Was versteht man unter somatischer Hybridisierung? Herstellung von Hybridpflanzen mit Hilfe der Fusion von Einzelzellen unterschiedlicher Herkunft -> hiermit will man die nützlichen Eigenschaften von Pflanzen vereinigen, die durch irgendwelche Faktoren nicht zu kreuzen sind
• Welche Art von Zellen wird für die somatische Hybridisierung verwendet? Protoplasten (denn Pflanzenzellen verschmelzen sehr leicht, wenn zuvor die Wände mit Hilfe eines Verdauungsenzyms für die Cellulose entfernt wurden)
• Welche Methoden zur somatischen Hybridisierung werden angewendet? chemisch mit Polyethylenglykol (PEG) bewirkt einen engen Kontakt zwischen Fusionspartnern erhöht die Flexibilität des Plasmalemmas in Gegenwart von Calcium- oder Magnesiuminonen Elektrofusion
• Was kann bei somatischer Hybridisierung schief laufen? die Verschmelzung der Kerne kann ausbleiben es volzieht nur ein Kern die Mutation, der 2.Kern geht verloren (es entstehen Cybride)
• Was sind Cybride? Fusionsprodukte, in denen keine Kernschmelzung stattgefunden hat besitzen gemischtes Cytoplasma entsprechen dem Karyotyp (=Erscheinungsbild eines Chromosomensatzes)  eines Fusionspartners
• Welche 4 Selektionsmethoden gibt es, um Hybride nach der Fusion von Protoplasten zu erkennen? Komplementation wenn die Ausgangszelllinien Mutantionen in zwei verschiedenen Strukturgenene haben Hybridpflanzen wären dann wieder voll funktionsfähig Doppelresistenz wenn Ausgangszelllinien je ein Resistenzgen gegen unterschiedliche toxische Substanzen haben Optische Selektion nur möglich, wenn z.B. chloroplastenhaltige und chloroplastenfreie Zellen benutzt werden Vergleich des Phänotyps der Hybridpflanzen mit den Ausgangspflanzen erst nach Regeneration der ganzen Pflanze möglich
• Warum sind haploide Pflanzen für die Züchtung interessant? manifestieren dominante und rezessive Mutationen phänotypisch können absolut homozygote diploide Pflanzen (Dihaploide Pflanzen) erzeugen
• Merkmale haploider Pflanzen für die Pflanzenzüchtung interessant Entwicklung aus Antheren oder Mikrosporen: haploide Androgenese (aus unreifen Pollen können sich haploide Pflanzen entwickeln) sind kleiner und steril genetisch nicht identisch und keine Klone
• Welche Bedeutung haben biotechnologische Methoden in der Landwirtschaft? fester Bestandteil der Zuchtmethodik (werden bei Züchtung von Gemüse- und Zierpflanzenarten teilweise eingesetzt) in einigen Arten finden intensive eigene biotechnologische Entwicklungen statt
• Definieren Sie Transformation Nonvirale Einbringung heterologer DNA in Wirtsorganismus (Bakterien, Hefe, Pflanze)
• Definieren Sie Transfektion Nonvirale EInbringung heterologer DNA in Säuger
• Definieren Sie Heterologe DNA Fremd- DNA, aus einem anderen Organismus
• Definieren Sie Vektor Fähre/ Vesikel zur Übertragung von Fremd-DNA
• Definieren Sie Reportergensysteme Geben Auskunft über den Erfolg/ Misserfolg einer Einbringung von Fremd-DNA
• Nenne Merkmale von Plasmiden sind ein Beispiel für Vektoren extrachromosomale, ringförmige DNA-Moleküle kommen bei Bakterien und Hefen vor können sich unabhängig vom Hauptchromosom vermehren haben also die Eigenschaft, sich in Bakterien zu vervielfältigen  
• Welche drei "Signale" benötigt ein geeignetes Plasmid? Replikationsursprung (ORi) eine bestimmte DNA-Sequenz, damit Bakterium erkennt, dass dieses Plasmid vervielfältigt werden soll MCS (multiple cloning site) Stelle, an der Fremd-DNA eingefügt wird hier befinden sich Schnittstellen für Restriktionsenzyme) Gene für Resistenzfaktoren (z.B. gegen Antibiotika) hiermit kann ich überprüfen, ob Bakterium Plasmid tatsächlich aufgenommen hat (dann überleben die Zellen auch bei Hinzugabe von Antibiotika) Plasmide , welche Transfergene (tra-Gene) besitzen, können von einem Bakterium auf ein anderes übertragen werden
• Woher stammen Ursprungsvektoren? Aus verschiedenen Mikroorganismen. Sie wurden aber für den molekularbiologischen Gebrauch verändert
• Was sind virale Vektoren? Sind von Bakteriophagen und Viren abgeleitet, die teilweise als einzelsträngige Moleküle vorkommen
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• Viele Vektoren sind Mischformen, was versteht man darunter? Vektoren, die bakterielle und virale Sequenten enthalten
• Beschreiben Sie die Transformation von Pflanzen mit Agrobakterium tumefaciens bei der Transformation werden gentechnische veränderte Pflanzen hergestellt agrobakterium tumefacies dient als natürliche Genfähre a.t. enthält ein Ti-Plasmid (tumor inducing), welches die Bildung eines Tumors in Pflanzen induziert Bei der Infektion einer Pflanzenzelle durch das Bakterium wird die so genannte T-DNA in die Zelle übertragen und an einer beliebigen Stelle in das Genom der Pflanze eingebaut diese Fähigkeit wird genutzt, indem man Bakterium als Vektor einsetzt Dabei werden zunächst die tumorbildenden Gene aus dem Plasmid des Bakteriums herausgeschnitten und stattdessen das gewünschte Fremdgen eingebaut.
• Wie verläuft die Infektion einer Pflanze mit dem Agrobakterium? erfolgt durch Verletzung der Pflanze verwundete Pflanzen geben phenolische Verbindungen ab agrobakterium tumefaciens wird chemotaktisch angelockt (Signalmoleküle werden von transmembranen Rezeptorkomplexen, die von virA kodiert werden, auf der Bakterienoberfläche detekiert) virA aktivieren vir G durch Phsophorylierung virG bindet an regulatorischen Regionen anderer Vir-Gene auf dem Ti-Plasmid Expression weiterer Vir-Gene virD2 schneidet als Endonuklease die T-DNA aus vir E2 bindet sich an gebildeten Einzelstrang, schützt ihn vor Abbau vir E2 leitet T-DNA zur bakteriellen Membran T-DNA gelangt über Porenkomplex in Pflanzenzelle unspezifische Intergration ins Pflanzenzellengenom
• Warum hat man "binäre Vektoren" entwickelt? Da es aufwändig ist, Fremd-DNA in ein Ti-Plasmid einzubringen da große Plasmide nicht sehr effizient transformiert werden
• Erläutern Sie das Grundprinzip/ Aufbau eines "binären Vektors" DNA wird nicht in Ti-Plasmid intergriert, sondern in ein zweites Plasmid eingebracht "vir-Helfer-Plasmid": hier wird T-DNA aus Ti-Plasmid entfernt, die Virulenzgene (virGene) bleiben aber erhalten "binärer Vektor" enthält keine vir-Gene T-DNA und vir-Gene müssen also nicht mehr auf dem selben Plasmid liegen somit kann die Größe der Ti-Plasmide deutlich reduziert werden (einfachere Handhabung im Labor, stabiler)
• Beschreibe kurz die drei Schritte einer Transformation mit binären Vektoren zu übertragender DNA-Abschnitt wird in Plasmid integriert, dieser Vektor wird in E.coli vermehrt Überführung des Plasmids mit zu übertragender DNA in Agrobakterien-Stamm (der ein Helfer-Ti-Plasmid ohne T-DNA enthält) Gemeinsame Kultivierung von Agrobakterium und Pflanzen-Balttstückchen. Das eine Plasmid überträgt sie "fremde" T-DNA, das andere hilft durch die Aktivität seiner vir-Gene bei der Transformation Aus den Blattstückchen werden wieder neue Pflanzen regeneriert
• Nennen und beschreiben Sie andere Methoden zur Transformation von Pflanzenzellen (ausgenommen b. Vektoren) Elektrofusion durch elektrische Impulse werden Membranen kurzzeitig durchlässig für geladene oder große Moleküle PEG (Polyethylenglykol) PEG veranlasst das Plasmalemma, sich einzustülpen und DNA durch Vesikelbildung (Endocytose) in den Protoplasten aufzunehmen Form mit geringem technischen Aufwand und vergleichsweise geringen Kosten Mikroinjektion Einbringung Fremd-DNA mit Mikroinjektionsnadel Protoplasten müssen während Injektion fixiert werden Partikelbeschuss-Technik (Gen-Kanone) mit Gold oder Wolfram gecoatete Nucleinsäuren werden beschleunigt und auf pfl.Zellen oder Gewebe geschossen
• Beschreiben Sie das Prinzip von Reportergenen machen Expressionsaktivität eines Gens sichtbar Reportergen wird dazu an den Promotor des jeweiligen Gens fusioniert, so dass bei genaktivität auch Reporter exprimiert wird  
• Welche Eigenschaften müssen Reporter-Gene haben? Erzeugte Gen-Produkte müssen einfach nachweisbar sein dürfen für Organismus nicht toxisch sein 
• Wodurch kann die Expression von Reportergenen überprüft werden? Messung einer Enzymaktivität unter Verwendung von farbigen, floureszierenden oder Lumineszenz-erzeugenden Substraten Durch Immunologischen Nachweis Histochemische Färbung
• Welche Reportergensysteme sind heute gebräuchlich? LacZ Reporter System Luc Reporter System Green fluorescent Protein (GFP) Reporter System Bioluminescence Reporter System
• Beschreibe kurz das LacZ Reporter System Gen:lacZ für Enzym, welches die Hydrolyse von ß-Galaktosiden und Laktosiden katalysiert Hydrolyse-Produkt färbt positive, also transformierte, Zellen blau
• Beschreiben Sie kurz das GUS Reporter Gene System kodiert für eine ß-Glucuronidase aus E.coli stabile Expression einfach Detektion mittels farbiger, fluoreszierender Enzyme beeinträchtigt nicht den Stoffwechsel der Pflanze
• Beschreiben Sie kurz das Luc Reporter System Enzym Luciferase Luciferase-Reaktion emittiert gelb-grünes Licht (Glühen >Luc) kann auch in lebenden Zellen Genexpression sichtbar machen
• Beschreiben Sie kurz das Green Fluorescent Protein (GFP) Reporter Gene Systeme emittiert eine grüne Floureszenz ohne das ein Enzym oder Co-Faktor erfolderlich wäre auch im lebenden Organismus einsetzbar GFP-Repoter-Gen ist ein gen für ein grün floureszierendes Protein
• Nenne Vorteile der "Dip"-Methode Zeitersparnis (keine Regeneration von transformierten Pflanzen zu ganzen Pflanzen notwendig -> Samen werden geerntet) Induzierung der stabil transformierten Pflanzen und ihrer Nachkommen aus der Dip-Methode mittels: "Markergen-Analyse" (PCR)
• Welches Anwendungspotential besteht bei transgenen Pflanzen? Zierpflanzenbau: Veränderung in Wuchsform und Blütenfarbe, Blütenform Gewinnung nachwachsender Rohstoffe Veränderung von pflanzlichen Inhaltsstoffen Phytoremediation: Abbau von toxischen Substanzen, Anreicherung von Schwermetallen

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