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Anchem (Subject) / Enzymatische Methoden (Lesson)
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- Enzyme Biokatalysoren unter physiologischen Bedingungen hohe Spezifität und Reaktivität verändern nicht die Gleichgewichtskonstante einer Reaktion verändern die Geschwindigkeit der Reaktion werden bei der Reaktion nicht verbraucht
- Enzymreaktion E+S<-->ES->E+P (E=Enzym,S=Substrat,ES=Enzym-Substrat-Komplex,P=Produkt) freie Enthalpie mit Enzym viel kleiner
- Michaelis-Menten-Gleichung Beschreibt Kinetik von Enzymen V=Vmax*[S]/Km+[S] Km=Michaelis Menten Konstante [S]=Substratkonzentration V=Reaktionsgeschwindigkeit
- Einheiten der Enzymaktivität Eine EH (unit, U) entspricht der Enzymmenge, die die Umsetzung von einem µmol Substrat pro min unter genau festgelegten Versuchsbedingungen katalysiert. Spezifische Aktivität: meist in units pro mg Gesamtprotein Molare Aktivität: units/mol Turnover numer: Aktivität pro mol aktives Zentrum
- Einflussgrößen auf die Enzymaktivität ph-Wert und Puffersystem Temperatur Auswahl des Substrats ( Substratspezifität unterschiedlich stark ausgeprägt) Substratkonzentration Enzymkonzentration
- Enzymatische Methoden analytische Bestimmung von Substanzen mit Hilfe von Enzymen: Substratkonzentration <<Km Ermittlung der Enzymaktivität:Substratkonzentration :Vmax Ermittlung der Enzymaktivität um adäquate Herstellung eines LM zu bestimmen
- Wärmebehandlung von Milch bei Dauererhitzen (62-65°C,30-32min) oder Kurzzeiterhitzen (72-75°C,15-30S): Phosphatase-Nachweis negativ Peroxidase-Nachweis positiv Bei Hocherhitzen (mind 85°C, mind 4s): Phosphatase-Nachweis negatv Peroxidase-Nachweis negativ
- direkte Messung/ gekoppeltes Testsystem direkte M.: wenn die Umsetzung des Substrats oder eines and der Enzymreaktion beteiligten Coenzyme selbst zur Veränderung eines leicht messbaren Parameters führt Gekoppeltes Testsystem:Verwendung eines zweiten Enzyms
- direkte Messung/ gekoppeltes Testsystem direkte M.: wenn die Umsetzung des Substrats oder eines and der Enzymreaktion beteiligten Coenzyme selbst zur Veränderung eines leicht messbaren Parameters führt Gekoppeltes Testsystem:Verwendung eines zweiten Enzyms
- Enzymatische Glu-Bestimmung β-D-Glucopyranose -->Glucose-Oxidase--> β-D-Gluoconolacton H2O2+o-Dianisidin-->Peroxidase-->H2O+oxidierter Farbstoff (gelb)
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- Vorteile von enzymatischen Methoden Hohe Speifität (durch Wahl eines Enzyms oder durch Kombination mehrer Enzyme) Nachweisgrenzen sind generell niedrig schnell und ohne großen Aufwand durchführbar eine Reihe von Enzymkits sind komerziell erhältlich