Biologie (Subject) / MiBi 3 (Lesson)

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• Mikrobielle Ökologie (Definition) Wechselbeziehungen zwischen Mikroorganismenund ihrer belebten und unbelebten Umwelt
• Charakterisierung mikrobieller Gemeinschaften - Anzahl und Zusammensetzung der Mikroorganismen, Biomasse (Struktur) - Rolle der Mikroorganismen in den biogeochemischen Prozessen, Gen- und Stoffwechselaktivitäten (Funktion) - räumliche und zeitliche Dynamik - Einfluss von Umweltfaktoren
• Vorgehen zur Analyse einer Probe man entnimmt eine Probe und versucht sich darauf befindliche Stämme zu kultivieren (Kultivierung von Isolaten, dann Identifizierung, Physiologie…) Das Problem dabei ist, dass sich nur ungefähr 0,001 – 15% der Mikroorganismen kultivieren lassen ("great plate count anomaly") deswegen braucht man kultivierungsunabhängige Methoden
• kultivierungsunabhängige Methoden: in situ Analysen (in der Regel am Objektträger fixierte Proben) (4) - direkte Zählung - Immunfluoreszenz - IS- PCR - Gesamtzellhybridisierung (FISH)
• In situ Analysen: Immunfluoreszenzfärbung Zuerst wird ein primärer Antikörper aus einem Kaninchen an die Zellwandkomponenten der Organismen auftragen. Ein sekundärer Antikörper (Anti-Kaninchen-IgG (Immunglobulin G) aus einem Schaf), der Fluorescein-markiert ist, wird hinzugefügt und fluoresziert bei Reaktion mit primärem Antikörper. Zusatz: Diese Methode erlaubt mehr Flexibilität, da eine Vielzahl von Primärantikörpern mit den gleichen markierten Zweitantikörpern kombiniert werden können (Kostenersparnis). Außerdem ist diese Methode um ein Vielfaches empfindlicher, da verschiedene Zweitantikörper mit den verschiedenen Epitopen des Primärantikörpers reagieren können.
• In situ Analysen: FISH (Fluoreszenz- in situ- Hybridisierung) Zellen müssen fixiert und permeabilisiert (Membran durchlässig für kleinste Partikel, oft DNA) werden. Eine markierte Sonde wird in die Zelle eingeschleust, z.b. eine Fluorophor-markierte Oligonukleotid-Sonde, gerichtetgegen die SSU rRNA (phylogenetische Färbung weil hochkonserviert, siehe MiBi 2) von Gordonia spec. mit verschiedenen phylogenetischen Sonden kann man gleichzeitig verschiedene Mikroorganismen anfärben und so mithilfe der Epifluoreszenz-Mikroskopie die Anordnung und Menge der einzelnen Spezies anzeigen.
• In situ Analysen: IS-PCR (direkte In-situ-PCR) - PCR im Innern von fixierten, permeabilisierten Zellen/Zellverbänden/Geweben; Markierung der Amplifikate, man kann DNA- Abschnitte bestimmten Zellen zuordnen - auch Sequenzen, die nur einmal in einer Zelle vorkommen, sind mögliche "targets" - "targets" können sehr vielfältig sein - kann gut zum Nachweis von bestimmten Spezies benutzt werden, durch die optische Kontrolle können falsch- positive Ergebnisse durch DNA- Kontamination reduziert werden. es gibt auch: indirekte PCR-in-situ-Hybridisierung (PCRisHyb)
• Analyse nach DNA Extraktion: fingerprinting: DGGE/TGGE (Denaturant Gradient Gel Electrophoresis / Temperature Gradient Gel Electrophoresis) 16S rRNA aus der DNA einer Probe isolieren und mit PCR vervielfältigen. Mithilfe der DGGE kann man die rRNA von Eu- und Prokaryoten trennen, die zwar in ihrer Länge identisch sind (Agarose- Gel- Elektrophorese nutzlos), aber durch Mutationen, vor allem in der Menge und Lage von G-C Bindungen einen verschiedenen Denaturierungsgradienten aufweisen (ab welcher chemischen Konzentration/Temperatur sich eine Basenbindung löst). Man kann außerdem grob die Menge und Vielfalt der einzelnen Mikroorganismen der Probe abschätzen. Aus der Elektrophoreseplatte kann man hinterher einzelne Banden isolieren und die darin enthaltene DNA mit PCR vervielfältigen und weiter analysieren. Aber:• Viele Genome enthalten mehrere,heterogene Kopien der rRNA Gene• Selten vorkommende Vertreter werdenu.U.nicht detektiert  
• Metagenomic library aus einer Probe Erde wird die DNA entweder direkt isoliert, oder zuerst die Zellen von der Erde getrennt und dann durch Zelllyse und Reinigung die DNA erhalten. Die DNA wird fragmentiert und in einen offenen, linearen Klonierungsvektor eingebaut. Das so erhaltene Plasmid wird in einen bakteriellen Wirt eingeschleußt. So erhält man eine bakterielle Datenbank der Probe, an der man weitere Analysen durchführen kann. 2011: > 210 Metagenome (versch Böden, Gletschereis, heiße Quellen, Salzseen, Ozeane,menschl. Darmtrakt,…,)
• Metatranscriptomics: Genexpressionsprofil der Lebensgemeinschaft gesamte RNA einer Probe wird isoliert. Von dieser RNA will man nun nur noch die mRNA haben, die etwa 5% der gesamten RNA Menge ausmacht. a) die rRNA wird durch magnetische Kugeln mit Sonden, die spezifisch an diese binden, aus der vermischten RNA entfernt. b) Es werden Exonucleasen hinzugefügt, die spezifisch 5'P RNA verdaut. (mRNA ist 5'PPP RNA) c) Mithilfe eines E Coli Poly (A) Polymerase Enzyms wird der mRNA selektiv ein Poly A Schwanz angehängt. Diese adenylisierte RNA kann von Sonden eingefangen werden Die isolierte mRNA wird mit einem reverse Transkriptase Enzym zu cDNA umgewandelt und dann entweder für eine Datenbankarchivierung vervielfältigt oder direkt sequenziert. Daraus kann man dann die Funktionen der Mitglieder der Lebensgemeinschaft (community members) ablesen.
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• cDNA complementary DNA, mithilfe eines reverse Transkriptase Enzyms aus RNA, meist mRNA synthetisiert. Daraus kann man die Expressionsraten der zugrundeliegenden RNA bestimmen.
• RT-PCR Reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion, aus RNA wird zuerst cDNA erstellt und diese dann mithilfe von PCR vervielfältigt, vgl. Metatranscriptomics
• FISH + Mikroelektroden/-sensoren für die Analyse der Aktivität der Gesamtbiomassse. Während mithilfe von FISH eine Bild der Bakterienkolonien erstellt wird, kann mithilfe von angebrachten Sensoren zusätzlich der Umsatz bestimmter Stoffe gemessen werden. Zum Beispiel zwei Sensoren für Nitrat und Sauerstoff, wenn Sauerstoff in einem Biofilm in Nitrat umgesetzt wird.
• Wachstum von Bakterienpopulationen (5) - Zellteilung- Exponentielles Wachstum- Wachstum in statischer Kultur- Einfluss von Milieufaktoren auf das Wachstum- Wachstum auf Oberflächen: Biofilme
• Zellteilung Zuerst DNA- Replkation in einzelner Zelle. Dann Zellelongation und Septumbildung (Das Septum ist die Trennwand zwischen beiden Tochterzellen). Das Septum wird fertiggestellt und getrennte Zellwände werden gebildet. Jede Tochterzelle erhält eine Kopie des Erbmaterials. siehe auch: Teilungsapparat
• Teilungsapparat, Divisom Es wird ein sogenannter FtsZ- Ring, strukturell ähnlich dem Mikrotubulin, gebildet. Verschiedene Proteine assemblieren an diesem z.b. als Verankerung in der Membran oder zur Peptidoglykansynthese. Nach der Zellverlängerung beginnt die Depolymerisation des Rings, das Zellwandmaterial wächst nach innen. So beginnt am Ring die Einschnürung der Zelle. ZipA: FtsZ- Anker FtsI: Peptidoglykanbiosyntheseprotein FtsK: Chromosomentrennung FtsA: ATPase
• exponentielles Wachstum einer Bakterienpopulation N0: Anzahl Zellen zum Zeitpunkt 0 Nt: Anzahl Zellen zum Zeitpunkt t n: Anzahl Zellteilungen lg Nt – lg N0                 n lg 2 (t - t0)          =         t    =    v  : Teilungsrate
• Wachstum in statischer Kultur (Batch-Kultur) - Keine Nährstoffzugabe oder Entfernung vonStoffwechselprodukten während des Wachstums- Bedingungen im Kulturgefäß verändern sich- Wachstum verläuft in Wachstumsphasen zuerst verändert sich die Zellmenge nicht, dann steigt sie schnell, stagniert und singt dann bis zum Nullpunkt. (lag phase, exponential phase, stationary phase, death phase)
• Einfluss von Milieufaktoren: Temperatur Temperaturspanne des Lebens: -15°C bis ca. 115°C höchste Wachstumsrate: Psychrophil: ca. 4°C - Mesophil: ca. 39°C - Thermophil: ca. 60°C - Hyperthermophil: ca. 88 - 106°C Wachstumsrate: - Minimum: Membran erstarrt, Transportprozesse stark verlangsamt, keine Zellteilung möglich - Optimum: Enzymatische Prozesse erreichen Maximalgeschwindigkeit - Maximum: Proteine denaturieren, Membran löst sich auf -> thermische bedingte Lyse
• Einfluss von Milieufaktoren: PH - Bakterien bevorzugen neutralen PH- Wert um 7. - Schmimmelpilze und Hefen haben eion breites Toleranzspektrum bevorzugen aber einen PH- Wert von 5-6. - Säure hemmt Wachstum der meisten Bakterien (Lebensmittelkonservierung, nicht so Milchsäurebakterien) - Acidophile, PH < 4, z.b. Schwefelsäure bildende Bakterien - Neutrophile, PH 6- 7 - Alkaliphile, PH > 8 , in Sodaseen, Böden mit hohem Carbongehalt
• Einfluss von Milieufaktoren: Wasseraktivität, osmotische Effekte Wasseraktivität aw: Maß an frei verfügbarem Wasser in einem Medium, beeinflusst durch Gehalt an osmotisch wirksamen Substanzen. Viele Bakterien sind nicht halophil und brauche eine aw > 0,98. Deswegen Konservierung durch Salz und Zucker, z.b. Marmelade mit aw = 0,8. In Salzseen aw = 0,75 Bei niedrigere Wasseraktivität: Erhöhung der inneren Konzentration an gelösten Stoffen. Z.b. Aminosäuren , Kohlenhydrate oder KCl bzw. Anhäufung “kompatibler Solute”
• Einfluss von Milieufaktoren: molekularer Sauerstoff Bei Reduktion von O2 entstehen toxische O-Formen wie H2O2 oder OH- Entgiftung toxischer O-Formen Aerobier: SOD (Superoxid-Dismutase Enzyme, die Superoxid- Anionen zu Wasserstoffperoxid umwandeln, in allen Lebewesen außer Anaerobiern) und Katalase (Enzym das H2O2 zu O2 und H2O umsetzt) Obligate Anaerobier: (wenig/) keine SOD
• Biofilme Biofilme bestehen aus einer dünnen Schleimschicht (Film), in der Mikroorganismen (z. B. Bakteriein, Algen) eingebettet sind. Biofilme entstehen, wenn Mikroorganismen sich an Grenzflächen ansiedeln. Typische Organisationsform vieler Mikroorganismen. - Fixierung auf (nährstoffreicher) Oberfläche- Zellen in extrazelluläre polymere Substanzen eingebettet- “Verteidigungsanlage”- Kommunikation erleichtert: Synchronisation der Stoffwechselaktivitätder Population (“quorum sensing”!!)- Genet. Austausch erleichtert.
• Messung des mikrobiellen Wachstums 1. Zellzahl: Plattenverfahren durch Verdünnungsreihen; Filtration: Wasser Filtrieren, Filter auf Nähragar legen und Kolonien Zählen; MPN (Most Probable Number): Für Bakterien, die nicht auf Nährböden wachsen, Verdünnungsreihen mit vielen Röhren anstellen, Bestimmung der Anzahl an Röhren, die Wachstum zeigen - statistische Auswertung 2. Direkte mikroskopische Zählung: Zählkammer mit Raster bei hoher Bakterienkonzentration; Elektronische Partikelzählung: Coulter counter: Zellsuspension mit Elektrolyt fließt durch Kapillaröffnung, bei erhöhtem Widerstand (Zelle) wird automatisch mitgezählt, dabei: Amplitude des Peaks proportional zur Partikelgröße 3. Zellmasse: Feucht- /Trockenmasse; Protein/DNA Bestimmung; Trübungsmessung im Photometer; Metabolische Aktivitäten; gesamter Kohlenstoff-/ Stickstoffgehalt

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