Biologie (Subject) / MiBi 2 (Lesson)

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• Klassische Taxonomie vs. Phylogenie Klassische Taxonomie: anhand des Phänotyps: zur Identifizierung Phylogenie: aufgrung genotypischer Einordnung: zur phylogenetischen Klassifizierung
• Indentifikation anhand der Morpholgie durch: (4) - Koloniemorphologie - Zellmorphologie - Cytologische Merkmale wie: Zellwand, Kapsel, Endosporen, allg. auffällige Strukturen und durch diverse Färbemethoden - Beweglichkeit, Begeißelung
• Färbeverfahren (6) - Gram- Färbung (Anzahl Mureinschichten) - Säurefestigkeitsfärbung nach Ziehl- Neelsen (fast nur Mycobakterien wegen langkettigen Mycolsäuren -> säurefest, geben Farbstoff nicht wieder ab) - Negativdarstellung der Kapseln durch das Anfärben der Umgebung, Farbstoff dringt nicht in die Kapsel ein - Endosporenfärbung - Geißelfärbung: Vergrößerung der Geißel durch Aufquellen, dann Färbung - Anfärben von Reservestoffgranula
• Kapsel auch Glykokalyx, aus Polysacchariden, außen an der Zellwand, fest an dieser verankert
• Suppline Wachstumsfaktoren, Nährstoffe
• Serologische Tests zur Identifizierung - Agglutinationstest: Mikroorganismen und Antiserum auf Objektträger - Fluoreszenzmarkierte Antikörper zur Bakterienkolonie geben - ELISA (Enzyme- Linked Immunosorbent Assay), Bindung bestimmterMikroorganismen aufgrund spezifischer Oberflächen-Antigene, ein Antikörper wird mit Enzym markiert, wenn Substrat in Produkt umgewandelt wird Farbreaktion o.ä. , kann deswegen auch zur quantitativen Bestimmung eingesetzt werden
• Chemotaxonomische Methoden (4) - Fettsäurenanalyse (Fettsäuren der Membranlipide haben charakteristische Muster) - Zellwandzusammensetzung - Chinone (bestimmte organische Verbindungen) - Pigmente
• DNA- DNA- Hybridisierung - zum vergleichen 2er Stämme, markierte gescherte DNA und unmarkierte gescherte DNA im Überfluss werden hitzedenaturiert und neu hybridisiert. prozentuale Hybridisierung verschiedener DNA- Stränge - 100 - 70% : Gleiche Spezies - 70 - 25% : Gleiche Gattung (Genus), verschiedene Spezies - 25 - 0% : Verschiedene Gattungen (Genera)  
• “molecular clock” Hypothese Annahme, dass die Substitutionsrate für eine gegebene DNA-Region in allen Zweigen einer Organismengruppe (oder eines ganzen Baums) konstant ist.Gilt nur für wenige Loci und eher eng gefasste taxonomische Gruppen. (siehe Sequenz der 16S/18S rRNA bzw. rDNA)
• Sequenz der 16S/18S rRNA bzw. rDNA für phylogenetische Vergleiche - in allen Organismen vorhanden, universell - in allen Organismen gleiche Funktion - hochkonservierte aber auch variable Bereiche -  kaum horizontaler Gentransfer - ausreichend groß, genug Information
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• 16S rDNA-Analyse Ribosomale RNA-Sequenzierung einer Reinkultur eines Mikroorganismus mit Hilfe der Polymerasekettenreaktion (PCR). Das 16S rRNA-Gen wird vermehrt und dann sequenziert. Die zugesetzten Primer sind zu den konservierten Sequenzen der 16S rRNA komplementär. (aus der DNA RNA- Stränge herstellen?)
• Distanz- Matrix- Methode evolutionäre Entfernung (ED) als Prozentsatz der nicht identischen Abschnitte der rRNA- Sequenzen zweier zu vergleichender Organismen. Wird statistisch korrigiert. Durch eine Computeranalyse werden die Daten verglichen und der warscheinlichste phylogenetische Stammbaum errechnet, inklusive proportional richtiger Länge der Zweige, die zwei Organismen trennen.
• Multilocus-Sequenztypisierung MLST Stämme innerhalb einer (z.b. pathogenen) Spezies vergleichen. "housekeeping genes" (nicht regulierte Gene) werden isoliert und mit PCR vermehrt, Sequenzierung, Bestimmung der Allele und Vergleichen mit anderen Stämmen
• “Fingerprint”-Methoden: Ribotyping Die gesamte DNA einer Kolonie wird isoliert, fragmentiert und dann elektrophoretisch aufgetrennt. Diese Fragmente werden mit markierten Sonden hybridisiert, die komplementär zu dem 16SrRNA-Gen sind. So werden die Fragmente, die Teile von 16SrRNA-Genen enthalten, sichtbar gemacht. -> “molekularer Fingerabdruck” (RiboPrint pattern)
• “Fingerprint”-Methoden: ARDRA = amplified rDNA restriction analysis 16S rRNA-Gene werden mit PCR vermehrt und dann mit verschiedenen Restriktionsenzymen verdaut. Aus diesen Restriktionsmustern kann man ARDRA- Profile erstellen und so verschiedene Spezies miteinander vergleichen.
• Definition einer Spezies in der Mikrobiologie - Sequenzidentität der 16S rRNA > 97% - DNA-DNA-Hybridisierung der Genome zu > 70% - Genom-Vergleich: >95% “average nucleotide identity”, gleiche DNA- Sequenzen - Jede Species ist phänotypisch einzigartig -> „Polyphasische Taxonomie“
• Polyphasische Taxonomie basiert auf einer breiten Basis vonphänotypischen und genotypischen Merkmalen, siehe: "Definition einer Spezies in der Mikrobiologie"
• 16S Sequenzierung vs. DNA:DNA-Hybridisierung Es kann vorkommen, dass zwei Organismen laut der DNA:DNA Hybridisierung zwei verschiedenen Spezies angehören (<70%), laut der 16S Sequenzierung aber der gleichen (>97%). Andersherum wird aber bei einer Hybridisierungsähnlichkeit über 70% nie eine 16S Ähnlichkeit unter 97 % gemessen.

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