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Trenn und Analysemethoden organischer Arzneistoffe (Subject) / stoff (Lesson)

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• Ionenpaarchromatographie Prinzip: Ionen werden durch Bildung von Ionenpaaren als Neutralverbindungen auf RP-Säulen getrennt.Verwendete Gegenionen:für Kationen: Alkylsulfonatefür Anionen: z.B. Tetraalkylammoniumverbindungen
• Ionenaustausch als tragendes Prinzip der chromatographischen Methoden: • Ionenaustauschchromatographie (IEC)• Chromatofokussierung
• Ionenaustausch Chromatographie (IEC) ... wird durchgeführt mit Ionenaustausch-Harzen.Ionenaustauscher (IAT): unlösliche Festsubstanzen mit Polyelektrolyt-Charakter, die aus Elektrolytlösungen Anionen bzw. Kationen aufnehmen können und dafür äquivalente Mengengleichsinnig geladener Ionen in die Lösung abgeben. Je nachdem, ob Anionen oder Kationen abgegeben werden → Anionen- bzw. Kationenaustauscher.• Häufig verwendet: Co-Polymerisate aus Styrol und Divinylbenzolmit ionischen funktionellen Gruppen an den Phenylresten.• starke IAT: bei jedem pH-Wert in ionischer Form• schwache IAT: nur in bestimmtem pH-Bereich ionisch Trennung infolge unterschiedlich starker Wechselwirkungskräftezwischen verschiedenen ionischen Analyten und den Festionen des IATstationäre Phase: ionische Stellen des Austauscherharzesmobile Phase: Elektrolytlösung
• Ionenaustauschchromatographie von Proteinen • Bindung des Proteins an eine Matrix über elektrostatische Wechselwirkung• Ausmaß / Stärke der Bindung ist abhängig von:– bei Proteinen bzw. zwitterionischen Verbindungen:pI des Proteins– Dichte der Ladungen auf der Matrix– pH-Wert des Elutionspuffers– Ionenstärke des Elutionspuffers (!) Zusammenfassung • Bei mehrstufigen Reinigungen günstigerweise IEC als 1.Stufe• Reinigungsfaktor: 3...15• Ausbeute: 50...80%• Vorteil (oft): Probe wird konzentriert
• Proteinreinigung mit IEC Durchführung • 1. Lösen des Proteins in Puffer niedriger Ionenstärke• 2. Bindung des (geladenen) Peptids an die fixierten Ladungen der stationären Phase• 3. Elution / Verdrängung von der stationären Phase Elution • Variante 1:– Start mit niedrig-konz. Puffer (10...20 mM)– Elution mit gradueller oder schrittweiser Erhöhung der Ionenstärke (NaCl: 0...1 M)• Variante 2:– Änderung des pH-Wertes des Eluenten
• Chromatofokussierung Prinzip • Proteine werden nach pI getrennt• Stationäre Phase: spez. Anionentauscher hoher Kapazität, besitzen viele kationische Gruppen mit unterschiedlichen pKa-Werten: Poly-Buffer Exchanger– PBE 94 (pH: 9...6, 7...4),– PBE 118 (pH: 11...8) • Startpuffer: pH = A• Elutionspuffer: pH = B• Elution nach sinkendem pI - unter gleichzeitiger Fokussierung Zusammenfassung • ähnlich einfach wie die IEC• Reinigungsfaktor: 5...50• Ausbeute: 50...80%• CF in Ggw. von nicht-ionischen Tensiden sowieHarnstoff und DMSO möglich
• Spezifische Bindung als tragendes Prinzip der chromatographischen Methoden: • Affinitätschromatographie• Ligandenchromatographie• Chirale Chromatographie
• Affinitätschromatographie An der Oberfläche eines inerten, polymeren Trägers sind Substanzen chemisch gebunden, die zu bestimmten Biomolekülen eine besonders hohe Affinität besitzen und diese daher hervorragend retinieren können. • schlechter Trennfaktor, aber hervorragender Reinigungsfaktor• spezifische (und reversible) Adsorption, z.B.– Antigene — Antikörper– Glykoproteine — Lectine ( ⇒ Lectin-Chromatographie)– Enzyme — Coenzyme – Rezeptor — Ligand die Trennmethode mit der größten Spezifität und Selektivitätfür Isolierung und Reinigung von Biomolekülen • Elution: Kompetitive Verdrängung aus der Bindung oder übereinen Konformationswechsel (pH-Wert-Änderung, Änderung derIonenstärke)
• Lektin-Chromatographie Lectin Affinity Chromatography (LAC) • Lektine sind v.a. in Pflanzen zu finden und haben als Proteine oder Glykoproteine hohe Affinität zu Zuckerresten.• Lektine binden spezifisch:– Monosaccharide– Polysaccharide– und daher auch: Glykoproteine• Reiche Auswahl von Lektin-gebundenen Matrices im Handel erhältlich:– WGA (Weizenkeimagglutinin)– Con A (Concanavalin A) Durchführung • Bindung der Glykoproteine unter hohen Salzkonzentrationen Bindung braucht Zeit! - mehrere Stunden, „über Nacht“ • Elution mit geeignetem „Elutions-Zucker“
• Liganden-Chromatographie Ligand Affinity Chromatography • Ligand, der das jeweilige Protein bindet, wird an eine Matrix gekoppelt• Matrix: Agarose, Polyacrylamid• Ligand: muß geeignete Funktionaliät für Bindung aufweisen (-NH2 > -COOH)• Bindung an die Matrix: über Spacer-Molekül Bindung des Liganden über -NH2/-COOH -> Aminosre knüpfung zwischen Matrix und Ligand Auftretende Probleme • von Seiten der Matrix:– Länge/Art des Spacers (hydrophob/hydrophil)– chemische Natur der Matrix– Porengröße der Matrix• von Seiten der Chromatographiebedingungen:– „Protein-Puffer“:• beteiligte Ionen und ihre Ionenstärke• pH-Wert• Seifen vorhanden?• von Seiten des Liganden– Protein wird nicht gebunden– Protein wird gebunden, aber nicht spezifisch eluiert• zu feste Bindung des Liganden• Protein wird unspezifisch gebunden (es bindet beispielsweise über Ladungen)
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• Liganden-Chromatographie Durchführung • 1. Kopplung des Liganden an die Matrix• 2. Intensives Waschen   – hohe + niedrige Ionenstärke   – pH 4 + pH 8• 3. Quantifizierung: Wieviel Ligand ist gebunden?• 4. Protein in geeignetem Puffer aufbringen• 5. Intensives Waschen• 6. Elution mit   – Ligand (entsprechend Schritt 1)   – „fremdem“ Ligand   – Elutionsmittel, das Bindungsaffinität herabsetzt   – Änderung von Ionenstärke und/oder pH-Wert
• Chirale Chromatographie • Zielsetzung: Trennung von Enantiomeren• Varianten:– Chirale stationäre Phase - „die eigentliche CC“– Vorsäulen-Derivatisierung der Enantiomere zu Diastereomeren ⇒ „normale“ LC ausreichend(d.h. stationäre Phase ist achiral)– Zusatz von chiralen Hilfsreagentien zur mobilen Phase ⇒ Ausbildung diastereomerer „Komplexe“ in der mobilen Phase (d.h. stationäre Phase ist achiral) • Stationäre Phase ist chiral:– Chirale Käfigverbindungen:Cyclodextrine,(chirale) Kronenether– Helicale Polymere: Cellulose-,Amylose-Derivate– Proteine– Chirale Moleküle,an Silicagel gebunden
• Molekülausschluss als tragendes Prinzip der chromatographischen Methoden: • Gelfiltration• Gel(permeations)chromatographie• Size Exclusion Chromatography (SEC)
• Gelchromatographie Prinzip: Molekularsieb-WirkungTrenneffekt durch sterischen Ausschluss (Molekülgröße bzw. Molekulargewicht), nur für Verbindungen ab einer best. Mindestgröße geeignet kleinere Moleküle diffundieren weiter in die Poren hinein→ längerer Aufenthalt in der stationären Phase→ langsamere WanderungMobile Phase: geeignetes LM (meist wässrige Pufferlösungen)Stationäre Phase: das selbe LM, und zwar dessen Anteil innerhalb der Poren Selektivität ergibt sich durch:o Trenngelo LM/Puffero pH-Werto Probenvolumen/Säulen-dimensionierung
• Elektrophorese Physikalische Grundlagen F = E . z E ... elektrische Feldstärkez ... Zahl der Ladungen/Teilchen F = 6π . r . η. v r ... Teilchenradiusη ... Viskositätv ... Teilchengeschwindigkeit Ionenbeweglichkeit u = die auf eine einheitliche Feldstärke vom 1 V/cmbezogenen Wanderungs-geschwindigkeiten v = u . E u=mobilität
• Wanderungsgeschwindigkeit in der Realität bei Elektrophorese • Radius der Ionen in Lösung <> Radius im Ionenkristall• Kugelförmige Ionen???• Ionenstärke• Dissoziationsgrad• Medium / Träger• Inhomogenitäten des elektrischen Feldes Einfluß des pH-Wertes• Starke Elektrolyte  – vollständig dissoziiert  – pH-unabhängig (in erster Näherung)• Schwache Elektrolyte  – unvollständig dissoziiert  – ausgeprägter pH-Einfluß um den pK-Wert• Ionen mit gleichem u lassen sich trennen, wennpK-Werte differieren Einfluß der Ionenstärke • Ionen behindern sich bei großer Ionenstärke (I)Trennungen bei möglichst geringer Ionenstärke, ausreichende Pufferkapazität allerdings erforderlich (Leitelektrolyt) Einfluß der Temperatur • vor allem durch Änderung der Viskosität bedingt
• Basis-Techniken in der Elektrophorese • (Trägerfreie Elektrophorese)• Elektrophorese auf Trägern• Isotachophorese• Disc-Elektrophorese• Präparative Elektrophorese• Kapillarelektrophorese (CE)
• Trägerfreie Elektrophorese nach Tiselius kaum praktische Bedeutung⇒ Bestimmung von Ionenwanderungsgeschwindigkeiten
• Elektrophorese auf Trägern • Trägermaterialien (1):– Pulver   • Sand, Glas, Stärke, PVC-Pulver, Aluminiumoxid– Gele  • Kieselgel  • Agargel, Agarosegel  • Stärke  • Polyacrylamid – Membranen  • Cellulose (Papier)  • Celluloseacetat  • PVC-Folie  • Glasfaserpapier  • Polyesterfilm • Vorteile– Beseitigung von Konvektionsströmungen– Strichförmiger Auftrag möglich (Zonenelektrophorese)• Nachteile – Porengröße bestimmt Größe/Masse trennbarer Proteine– Elektroosmose (Endoosmose)– Chromatographie-Effekte
• Gelmaterialien (1): Agarose • Vorteile:– ungiftig– einfach herstellbar– ideal für hochmolekulare Proteine (MW > 500 kDa)• Nachteile:– nicht vollständig klar, bei Färbung u.U. Probleme wegen Hintergrundfärbung– nicht Endoosmose-frei• Einsatzgebiet:– Trennung von Nukleinsäuren und hochmolekularen Proteinen
• Gelmaterialien (2): Polyacrylamid • chemisch inert• hergestellt durch Polymerisation von Acrylamid mit Quervernetzer• Porengröße durch Verhältnis Acrylamid / Quervernetzer einstellbar• Polymerisation unter Luftausschluß durchführen (ist auch pH- und Temp.-abhängig), Nachpolymerisation beachten • Vorteile:– stabil– klar, gut zu färben– gute Siebwirkung– fast ohne Endoosmose• Nachteile:– giftig!!! (Monomer!)– für Proteine < 800 kD• Einsatzgebiet:– Trennung von Proteinen
• Färbungen - Proteine • Sichtbarmachung und Quantifizierung direkt im Gel• Färbemethoden für Proteine:– Coomassie-Brilliant-Blue– Silberfärbung– Spezielle Färbemethoden– Autoradiographie– Fluorographie
• Fluoreszenzfärbung Proteine • Fluoreszenzfarbstoffe:– SYPRO-Ruby (Ru2+-Komplex mit 3x 4,7-Diphenyl-1,10-phenanthrolin-Liganden), -Red, -Orange, -Tangerine– Flamingo, Krypton, Lucy 506• Durchführung: Farbstofflösung in 1% Essigsäure anbieten• Anregung durch UV-Strahlung• Lichtempfindlich!• Nachweisgrenze: <= 1 ng Protein (entspricht Ag-Färbung)
• Spezielle Färbungen Proteine • Ausnützen spezifischer Reaktionen: – Enzym - Substrat: durch Substrate mitgekoppelten Diazofarbstoffen– Antigen - Antikörper: mitFluoreszenzfarbstoffen markiert
• Autoradiographie Proteine • Schwärzung von Röntgenfilmen durch radioaktiv markierte Proteine• Nachweisgrenze: naturgemäß zu den empfindlichsten „Färbemethoden“ gehörend
• Fluorographie Proteine • Gel wird mit Fluoreszenzfarbstoffen behandelt, diedie Radioaktivität in Fluoreszenzstrahlung umwandeln• Nachweisgrenze: naturgemäß zu den empfindlichsten„Färbemethoden“ gehörend
• Färbungen - Nukleinsäuren • Sichtbarmachung und Quantifizierung direkt im Gel• Färbemethoden für Nukleinsäuren:– Ethidiumbromid-Färbung • wird in die RNA bzw. DNA eingelagert (Interkalation)• Veränderung des Absorptionsspektrums• Verstärkung der Emission (nimmt mit Kettenlänge zu)• NWG: 1 ng• Achtung! Als Interkalator kanzerogen– Silberfärbung • Sehr empfindlich, da RNA bzw. DNA polyanionischsind (⇒ 1 Ag+ pro Base)• heute nur wenig verwendet– Fluoreszenzfärbung SYBR Green I-Färbung SYBR Gold-Färbung
• Densitometrie • Quantitative Auswertung der Protein-spots durchMessung der Färbungsintensitäten:– Messung der Absorption– Messung der Fluoreszenz• Durchführung mit kalibrierten Scannern + Computerauswertung (mit spezieller Software)
• Densitometrie - Probleme • Verhältnis Proteinmenge/Farbstoffmenge stark schwankend (Beispiel: Wieviel Ag+-Ionen binden an ein Protein?)• Große Spots haben relativ weniger Farbstoff zur Verfügung als kleine• Meßbereich nicht überragend• Zielsetzung?– Dokumentation– Quantitative Auswertung (v.a. für Proteine)
• Methoden der Gel-Elektrophorese • Zonenelektrophorese• SDS-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese• Isoelektrische Fokussierung• Zweidimensionale Gel-Elektrophorese• Disk-Elektrophorese
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• Zonenelektrophorese • Trennprinzip ist die unterschiedliche Mobilität(der geladenen (!) Teilchen) im elektrischen Feld• Mobilität ist abhängig von:– Ladung (abh. von pH-Wert und Temperatur)– Größe– Form Nativ-Elektrophorese - Puffersysteme• Saure bzw. neutrale Proteine:– Tris-HCl, Tris-Glycin (pH 9,1)– Tris-Tricin (pH 7,6)• Basische Proteine:– Glycinacetat (pH 3,1)– Aluminiumlactat (pH 3,1)
• SDS-PAGE • Sodium Dodecylsulfat Polyacrylamid GE• Denaturierende GE• SDS überdeckt die Eigenladungen des Proteins: Es entstehen Micellen mit konstanter negativerLadung pro Masseneinheit• ca. 1,4 g SDS / g Protein • Probenvorbereitung– Erhitzen in Ggw. von SDS auf 95 °C– ß-Mercaptoethanol (oder Dithiothreitol)spalten Disulfidbrücken• Hohe Auflösung auf „Lämmli-Gelen“: Disk-GE mit SDS-hältigem Tris-HCl/Tris-Glycin-Puffermr ~ log MW
• Isoelektrische Fokussierung • Trennmedien:– Großporige, sehr dünne Gele auf Folien:Polyacrylamid, Agarose• pH-Gradienten:– freie Trägerampholyte: niedermolekulare,synthetisch hergestellte aliphatische OligoaminoOligocarbonsäuren. • niedermolekulare, synthetisch hergestelltealiphatische Oligo-Aminosäuren und OligoCarbonsäuren• Eigenschaften:– hohe Pufferkapazität und Löslichkeit am pI– gute Leitfähigkeit am pI• pH-Gradient baut sich beim Anlegen deselektrischen Feldes auf! Immobilisierte pH-Gradienten• sind in die Gelmatrix einpolymerisiert: Immobiline
• Kapillarelektrophorese (CE) • Elektrophorese in dünnen Kapillaren unter Ausnützung der Elektroosmose• 1981: Jorgenson: CE in einer Quarzkapillare (Innen-Ø: 75 µm; Spannung: 30 kV) mit Fluoreszenzdetektion• Methode der Ph.Eur. (2.2.47) • Kapillaren: 50...100 µm Innen-Ø(herstellbar bis 5 µm) aus amorphemQuarz (fused silica)• Gesamtvolumen der Kapillare: wenige µL• Injektionsvolumen: wenige nL!• Spezielle Injektionstechniken nötig...
• Detektion Kapillarelektrophorese • UV (variable Wellenlänge, Diodenarray)• Fluoreszenz-Detektion• Elektrochemischer Detektion• Radioisotopen-Detektor• Leitfähigkeitsdetektor• Brechungsindexdetektor• Massenspektrometer
• Methoden der CE – Zonenelektrophorese– Trennung nachGröße/Ladung– Für kleine Ionen, Peptide, Proteine Die gesamte Kapillare ist mit Trägerelektrolyt gefüllt, die Feldstärke ist über den gesamten Trennbereich konstant. – Isoelektrische Fokussierung (CIEF)– Trennung nach Ladung (isoelektrischer Punkt)– ProteinepH-Gradient wird durch eine große Anzahl von Ampholyten mit unterschiedlichen pH-Werten gebildet.Kapillare wird mit Mischung von Ampholyt und Probe gefüllt. Die Ampholyt-Ionen bauen einen pH-Gradient auf Grund ihres pI-Wertes auf. – Kapillaraffinitätschromatographie (CAE)– Trennung nach Größe/Ladung– Ausnützen der Protein/LigandWechselwirkungVoraussetzung: Protein + Ligand zeigt gegenüber Protein (allein) andere Ladung oder (wesentlich) anderes Molekulargewicht.Durchführung: Zur Pufferlösung werden verschiedene Konzentrationen des Liganden zugesetzt. – Micellarelektrokinetische Chromatographie (MEKC)– Trennung nach Polarität– Für Neutralteilchen,Aminosäuren – Chirale Micellarelektrokinetische Chromatographie– Trennung nach Polarität– zur Enantiomerentrennung – Kapillargelelektrophorese– Trennung nach Molekülgröße– Proteine, DNA
• Präparative Techniken der Elektrophorese • Präparative Zonenelektrophorese• Präparative Isoelektrische Fokussierung• Free-Flow-Elektrophorese• Hochauflösende zweidimensionale Elektrophorese• Elektroelution
• Free-Flow-Elektrophorese • Trennung im kontinuierlichen Pufferstrom• eigentlich eine trägerfreie Elektrophorese• Trennzelle: horizontal oder vertikal• Verschiedene Methoden:  – Zonenelektrophorese  – IEF  – Isotachophorese
• Elektroelution Die Elektroelution erfolgt in einer Gelelutions-Elektrophoresekammer unter Anlegen einer Spannung. Ebenso wie geladene Moleküle während einer Gelelektrophorese in ein Gel einwandern, können sie aus dem Gel in eine Lösung auch herauswandern.
• Blot-Techniken Gele • Übertragung 2D-Gel ⇒ Membran, die Nachweis- und Quantifizierungsreaktionen zuläßt• Southern Blot (nach E.M.Southern): DNA• Northern Blot: RNA• Western Blot: Proteine
• Tank-Blotting • Gel und Membran werden zwischen Filterpapiere + Schwämme gelegt• Elektrophoretische Übertragung bei kleiner Spannung• Effiziente Kühlung nötig!
• Semidry-Blotting Horizontales „Blot-Sandwich“• Durch die elektrochemische Ra. an den Elektroden (Wasser) stellt sich ein pHGradient ein (Kathode: pH 12; Anode: pH 2)• Beschwerung nötig, da die entstehenden Gase den Stapel auseinanderdrücken• Keine Kühlung nötig!
• Kapillar-Blot Sog durch Kapillarkraft bei Filterpapier-Stapel
• Blot-Membranen - Materialien • früher: Nitrocellulose (löst sich in org.LM)• Polyvinylidenfluorid (PVDF)• Polypropylen (PP)• Siliconisierte Glasfasern (SGF)
• Biopharmazeutika • engl. Biopharmaceutics / Biopharmaceuticals• Überbegriff für Arzneistoffe, die biotechnisch hergestellt werden:  – Proteine (inkl. Antikörper)  – Nukleinsäuren (inkl. Antisense-Wirkstoffe)  – Viren, Bakterien (⇒ Impfstoffe)
• Biologika • engl. Biologics / Biologicals• recht unterschiedlich definiert:  – als Untergruppe der Biopharmazeutika: Arzneistoffe aus Zellen und Geweben abgeleitet  – Arzneistoffe biologischen Ursprungs (tierisch, pflanzlich, human) inkl. / exkl. gentechnisch hergestellter Produkte  – nur gentechnisch hergestellte Produkte  – Blutprodukte • Ausgangsmaterial ist biologischen Ursprungs (Plasma, Zellen, Gewebe, Organismen)• Hochmolekularer Wirkstoff ((Glyko)-Protein, Polysaccharid)• Charakterisierung ist nur durch eine Kombination von physiko-chemischen undbiologischen Testmethoden möglich (qualitativ und quantitativ)
• Beispiele für Biologika • Impfstoffe• Plasmaprodukte (z.B.: Gerinnungsfaktoren, Immunglobuline, Humanalbumine)• Proteine, bio- bzw. gentechnisch hergestellt• Monoklonale Antikörper• Urinary Derived Products, z.B. Hormone• Allergenzubereitungen• Heparin
• Herstellung von Biologika • Biologika werden aus tierischen, pflanzlichen oder humanen Zellen, Geweben oder Organen gewonnen – Konsistenz in der Herstellung (produktionsbedingte Unterschiede) – Verunreinigungen durch (un)definierte biologische Bestandteile – Verunreinigung durch Mikroorganismen oder Fremdgewebe
• Qualität von Biologika • Einführung einer Chargenfreigabe (OCABR)durch OMCLs in den EU-Mitgliedsstaaten• EDQM: Human OCABR Guidelines
• Nicht-proteinogene Aminosäuren (in Peptiden / Proteinen) • werden „außerhalb“ der Translation eingebaut• Abgeleitete Aminosäuren > leiten sich von den proteinogenen Aminosäuren ab• D-Aminosäuren, z.B. D-Serin, D-Aspartat (ZNS-Funktionen - auch beim Menschen!), zahlreiche D-Aminosäuren bei Bakterien (Peptidantibiotika)

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