269

Trenn und Analysemethoden organischer Arzneistoffe (Subject) / stoff (Lesson)

This lesson was created by blob24.

Learn lesson

back  |  next 3 / 6

• Nernst´ sches Verteilungs Gesetz K= ca Phase 1 / ca Phase 2 K.....konz. Substanz a K abh. von Temp und Druck
• Trennfaktor ß Maßzahl für Trennbarkeit ß=Ka/Kb • „Normale“ Verteilungschromatographie: polare stationäre Phase(z.B. H2O), apolare mobile Phase (organ. LM)• Umkehrphasen-Verteilungschromatographie (reversed phase): apolarestationäre Phase (z.B. Paraffinöl, Silikonöl), polare mobile Phase (H2O-hältiges LM-Gemisch; z.B. H2O/Methanol, H2O/Acetonitril, etc.)
• Verteilung als tragendes Prinzip der chromatographischen Methoden: • Hochleistungsflüssigchromatographie an modifizierten .. Phasen (RP-HPLC) (RP = Reversed Phase)• Hochleistungsdünnschichtchromatographie an modifizierten. Phasen (HPTLC)• Papierchromatographie (PC)
• Wanderungsverhalten verschieden polarer Substanzen in der SC Adsorptionschromatographie: apolare Substanzen wandern immer schneller als polare SubstanzenVerteilungschromatographie: Umkehrung des Wanderungsverhaltens möglich -> reversed Phase
• Dünnschichtchromatographie (DC) Pros and Cons • geringer apparativer Aufwand (billig). ⇒ ideal für Analytik in der Apotheke• geringer Zeitaufwand• hohe Trennleistung• niedrig-liegende Nachweisgrenzen• hohe Selektivität des Nachweises
• DC: Charakteristika Trennstrecke besteht aus dünner Schicht stationärer Phase, die sich auf einer geeigneten inerten Unterlage (Glas, Aluminium-, Plastikfolie) befindet. Die Trennung erfolgt näherungsweise in zweiter Dimension (Unterschied zu SC). → Flat-Bed – Methode. Trennmechanismen: am häufigsten Adsorption, Verteilung (ev. auch Ionenaustausch) Anwendungsmöglichkeiten: analytisch, mikropräparativ (100 mg Maßstab) für Trennung größerer Stoffmengen nur wenig geeignet (dafür ist SC besser)
• DC: Sorbentien • Kieselgel• Aluminiumoxidbasisch (pH ≈ 9.0)neutral (pH ≈ 7.5)sauer (pH ≈ 4.0)• Kieselgur• Polyamid (Nylon, Perlon)• Cellulose• Acetylierte Cellulose• Dextrangele• Stärke
• Adsorptionskraft des Sorbensmaterials → Aktivität hängt ab von: • Teilchengröße (kleine Teilchen → große spezifische Oberfläche (z.B. Kieselgel 60: 500 m2 /g); in DC ca. 0,5...25 µm• Zahl und Durchmesser der Kanäle (Poren), die bei der Herstellung entstehen• Wassergehalt des Sorbens Herstellung der Schichten: heute prakt. nur mehr industriell
• DC: Auftragen der Substanzen etwa 5 - 20 µg Substanz in einem Lösungsmittel, das die Substanz gut löst:z.B. Aceton, Methanol, Ethanol, Dichlormethan 0.1 - 5%ige Lösungen, 2 - 20 µl mit Mikropipetten, Mikroliterspritzen Belastbarkeit: 10-5 g/g SorbensEntwicklung des Chromatogramms erst nach völligem Abdunsten des zumAuftragen verwendeten Lösungsmittels (Platte abfönen)• punktförmiges Auftragen: v.a. in analytischer DC• strichförmiges (bandförmiges) Auftragen: v.a. in präparativer DC
• DC: Thermomikro-Auftrageverfahren nach Stahl (TAS) spezielles Verfahren zum Auftragen leicht flüchtiger Substanzen aus komplexer Matrix (z.B. aus pflanzlichem Material)
• Advertisement
• DC: Auswahl des Fließmittels • Nacharbeiten vorgegebener Arbeitsvorschriften: Lösungsmittel mitdefinierter Reinheit und def. Wassergehalt verwenden (p.A.-Qualität)• eigene Methodenentwicklung– Struktur der Probenmoleküle bekannt → Abschätzung derPolarität → Abschätzung der erforderlichen Elutionskraft Reihung der Lösungsmittel nach steigender Elutionskraft in Verbindungmit einem bestimmten Sorbens, bezogen auf n-Pentan als Nullpunkt→ elu(o)trope Reihe – unbekannte Eigenschaften der Analysensubstanz → Auswahl desFließmittels durch „Versuch und Irrtum“; experimentell raschdurchzuführen mittels Mikrozirkulartechnik
• DC: Auswahl des Fließmittels wie genau mittels Stahl‘schem Dreieck
• Mikrozirkulartechnik mehrere Versuche nebeneinander auf einer einzigen DC-Platte möglich(geringer Platzbedarf) ringförmige Auftrennung 
• DC: Fließmittelmischungen • Gemische von Lösungsmitteln mit sehr großem Polaritätsunterschiedvermeiden → Möglichkeit der Ausbildung einer β-Front (teilweiseEntmischung des Fließmittels auf der DC-Platte)
• DC: Entwicklung des Chromatogramms häufigste und einfachste Form: aufsteigende Entwicklung:• ohne Kammersättigung (Problem der nicht konstanten FM-Zusammensetzung)• mit Kammersättigung (bessere Reproduzierbarkeit) • Laufstrecken meist 5...15 cm• Laufzeit meist 10...30 minbei aufsteigender DC unter Kammersättigung verhalten sichdie Laufzeiten wie die Quadrate der Laufstrecken
• DC: Spezielle Kammern Sandwich-Kammer Doppeltrog-Kammer
• DC: Beschreibung des Migrationsverhaltens • RF-Wert• RX-Wert (RSt-Wert)RF-Wert immer zwischen 0 und 1RX Wert auch > 1 möglichhRF-Wert = RF-Wert x 100RF: Retentionsfaktor Rx= Front Probe/ Front Standard
• DC: Abhängigkeit des RF-Wertes RF-Wert wäre eigentlich substanzspezifische Kenngröße, wären alleEinflussfaktoren vollständig kontrollierbar; dies ist aber nicht der Fall,daher gewisser Schwankungsbereich.Experimentelle Faktoren, die den RF-Wert beeinflussen können:• durchschnittliche Korngröße• Aktivierungsgrad• Luftfeuchtigkeit• Schichtdicke• Art der Schichtherstellung• Sättigungsgrad der Kammeratmosphäre• Entwicklungstechnik• Länge der Laufstrecke• Substanzmenge u. a.
• DC: Spezielle Entwicklungstechniken Mehrfach-Entwicklung bei ungenügender Trennung, vor allem bei präp. DC;Trocknen, neuerliche Entwicklung mit gleichem FM→ Trennstufenzahl ist dadurch zu vergrößern.Berechnung, dass bei der DC die Auflösung am besten bei einem RFvonca. 0,3 ist. (kleiner → zu geringe Trennstufenzahl; größer → Auflösungsverschlechterung durch Fleckenverbreiterung)Berechnung des RF-Wertes nach Mehrfach-Entwicklung: nRF = 1-(1-Rf)n
• DC: Spezielle Entwicklungstechniken Stufentechnik nach Entwicklung mit FM 1 → Trocknen → Entwickeln mit FM 2vor allem, wenn präp. Trennung von mehreren polaren und mehrerenunpolaren Verbindungen erfolgen soll: stark polares FM bis zur halbenPlattenhöhe → dann schwach polares FM bis oben.
• DC: Spezielle Entwicklungstechniken Keilstreifentechnik vor allem bei knapp beieinander liegenden RF-Werten.Nach der Verjüngung tritt zusätzlich zurStrömung in Laufrichtung eine dazu senkrechte Strömung auf, welche die Substanz-Zonen quer zur Laufrichtung und damit auseinander zieht.
• DC: Spezielle Entwicklungstechniken Zirkulartechnik FM wird über einen Docht im Plattenzentrum zugeführt.Die Chromatographie erfolgt kreisförmig in alle Richtungen. RF(circ) = wurzel RF(lin)
• DC: Spezielle Entwicklungstechniken Zweidimensionale Entwicklung Art der Ausführung:• mit zwei verschiedenen FM zur besseren Trennung schwer trennbarer. Gemische (z.B. Arzneistoff in biolog. Proben)• mit gleichem FM:falls während der Analyse keine Veränderung der Substanzen eintritt → Punkte nach der 2. Entwicklung auf einer Diagonalen tritt Reaktion auf aktiver Oberfläche während der Chromatographie (oder beim Zwischentrocknen) ein → Punkte liegen nicht auf Diagonale
• DC: Spezielle Entwicklungstechniken TRT-Technik TRT-Technik (Trennung - Reaktion - Trennung)damit kann die chemische Reaktionsfähigkeit von Substanzen untersucht werden.Mögliche Reaktionstypen:• Oxidation• Hydrolyse• Photochemische Reaktionen• Halogenierungen (z.B. mittels Br2-Dampf)
• DC: Detektion der Substanzen • Eigenfarbe• Fluoreszenza) bei Tageslichtb) durch Anregung mit UV366 (UV-Lampe)• Fluoreszenzminderung: erfordert Fluoreszenzindikator (Anregungsstrahlung: UV254)• chemische Farbreaktionen (→ Sprühreagentien), z.B.: I2 (Lsg. od Dämpfe) braune Flecken bei basischen N-VerbindungenKMnO4 weiße Flecken auf rosa Grund bei reduzierenden Verb.Dragendorff orange-gelbe Flecken bei AlkaloidenFeCl3 zart-violette Flecken bei Phenolen (int. grün bei 1,2-Diphenolen)Ninhydrin blauviolette Flecken bei Aminosäuren
• High Performance Thin Layer Chromatography (HPTLC) facts Schichtdicke 0,19 mmFleckdurchmesser 0,3...0,5 mmTeilchen 5 µm (eng klassiert)Trennleistung ca. 3 x DCTrennstrecke 1 - 3 cmEntwicklungszeit 2 - 3 minNachweisgrenze 0.5 - 5 ng (DC: 5 - 50 ng)
• HPTLC: Auftragen der Substanzen in Lösung mit geeigneten Mikroliterspritzenspezielle Auftragevorrichtung (z.B. „Linomat“)
• HPTLC: Entwicklung meist horizontal in Flachkammern, sodass praktisch kein Gasraum → daher hervorragende Reproduzierbarkeit. Phasenfluss ist konstant; Zufuhr des FM mittels Kapillareffekt (hydrostatisch mit FM versorgt).
• HPTLC: Detektion meist mittels Densitometer = DC-Scanner (bzw. HPTLC-Scanner) → rel. genaue quantitative Auswertung möglich: Platte wird von Lichtstrahl abgetastet, Intensität des durchtretenden oder diffus reflektierten Lichtes wird  gemessen und als Kurve aufgezeichnet
• DC: Anwendung • Analytikideale chromatographische Methode zur Identifizierung in der Apotheke (geringer apparativer Aufwand, geringe laufende Kosten)Methode der Ph.Eur. (2.2.27 Dünnschichtchromatographie)Reaktionskontrolle in der SyntheseAusarbeitung von SC-Trennungen• Präparative Trennunggute Methode zur Auftrennung im 50...500 mg Bereich(„präparative“ Platten mit dickerer Schicht, z.B. 2 mm, verfügbarbzw. mit Auftragegerät selbst herstellbar)
• Advertisement
• Papierchromatographie (PC) • Verteilungschromatographie zwischen– Cellulose (Papier) + Wasserhaut bzw.– Cellulose und adsorbierter, polarer Flüssigkeit aus dem Fließmittel und Fließmittel• Arzneibuchmethode (Ph.Eur. 2.2.26 Papierchromatographie),allerdings nur mehr in wenigen Monographien eingesetzt(z.B. zur Identititäts- und Reinheitsprüfung radioaktiver Arzneimittel)
• Säulenchromatographie Was ist dabei besonders zu beachten? 1. Wahl der richtigen Säule Analytische oder präparative Trennung?Präparativ: Welche Substanzmengen sollen getrennt werden?Säulen: • Verhältnis Durchmesser / Länge: ca. 1 : 40 • Durchmesser: 0,5 cm ... mehrere Meter (Industrie) 2. Vorbereitung der stationären PhaseBeispiel: Kieselgel 60Stationäre Phase muss „homogen“ sein, bereits mit mobiler Phasegesättigt:Variante 1: Kieselgel einfüllen, mehrfach mobile Phase durchlaufen lassen,bis Säule homogen erscheintVariante 2: Kieselgel im Laufmittel aufschlämmen, in Säule füllen,mobile Phase ablaufen lassen 3. Aufbringen der ProbeProbe möglichst konzentriert als schmale Startzone aufbringen.Mit Seesand abdecken (verhindert, dass beim Zugeben der mobilen Phasedie Startzone „aufgewühlt“ und verdünnt wird) 4. ElutionMobile Phase aufbringen, Säulenhahn öffnen... • Schwerkraftsäule• Flash-Chromatographie: präparative SC unter leicht erhöhtemDruck– Vorteil: schneller– Nachteil: schlechtere Trennung
• SC: Sorbentien Sorbentien: alle schon bei der DC angeführten Materialien; Teilchendurchmesser meist ca. 100 µm; Sorbens-Aktivität kann hier vergleichsweise einfach festgelegt werden. Al2O3 Kieselgel
• SC: Stationäre Phase Problem der gleichmäßigen Dampfraumsättigung (s. DC) entfällt bei SC; Gleichmäßigkeit der Säulenfüllung wichtig für Trennergebnis → Einschlämmen des Füllmaterials; Fließmittel wandert infolge der Schwerkraft, ev. geringer Überdruck (bis ca. 5 bar, MPLC "medium pressure liquid chromatography"), falls Strömungsgeschwindigkeit bei Verkleinerung der Teilchengröße zu stark abnimmt. In der Adsorptions-SC gelten die bekannten Elutionsreihen. Übliche Druchflussrate 1-10 ml/min. Auffangen von Eluatfraktionen (automatisierbar).
• SC: Elutionstechniken Substanzgemisch wird in konzentrierter Lsg. aufgetragen, mit FM so langeentwickelt, bis alle Substanzen nacheinander die Säule verlassen haben • Gradienten-Elution: Elutionskraft wird stetig erhöht • isokratische Elution: FM-Zusammensetzung konstant
• SC: Gradientenelution • Verkürzung der Analysenzeit• Verringerung des LM-Verbrauchs• Verbesserung des Trennergebnisses durch Zurückdrängen von Tailing• Verbesserung der Peakform (schmäler, dafür höher), wichtig bei Peaksmit großer Retentionszeit• innere Gradienten: Polaritäts-, pH-, Konzentrations-, Ionenstärke-Gradienten• äußere Gradienten: Temperatur, Durchflussrate
• SC: Andere Entwicklungstechniken FrontaltechnikVerdünnte Lösung des zu trennenden Gemisches im Fließmittel wirdkontinuierlich auf die Säule aufgegeben. Substanz mit geringster Retentionerscheint als erste im Eluat rein, weitere Fraktionen sind dann Mischfraktionen.Anwendungsbeispiele:Entfernung von Peroxiden aus LM (Ether)Entfernung von Stabilisator-EtOH aus ChloroformEntwässern von LM
• SC: Detektion • diskontinuierlichZeit- oder Volumengesteuerte Fraktionskollektoren; Untersuchung der einzelnen Fraktionen mittels Farbreaktionen, DC, GC,...• kontinuierlich - erfordert Detektora) UV/Vis-Durchflussphotometer 10-9 g/ml (mit konstanter oder mit variabler Wellenlänge)b) Fluorimeter 10-10 g/mlc) Polarograph 10-11 g/mld) Differentialrefraktometer 10-7 g/ml
• Aufbau eines HPLC-Systems für Gradientenelution LM 1/2 -> Mischer -> Pumpe -> Einlaßsystem -> Säule -> Detektor -> PC
• HPLC - Apparatives: Pumpe(n) Anforderung: möglichst gleichmäßige Fließgeschwindigkeit der mobilen Phase.Häufigster Pumpen-Typ: Kurzhub-Kolbenpumpe → Kolben (meist auskünstl. Saphir) über Nockenwelle angetrieben; hohe Anforderungen anDichtungen (bes. bei Verwendung aggressiver Medien: Puffer, Salzlösungen);Einlass- u. Auslassventil (Kugeln); Förderleistung meist 0-10 ml/min Pulsationen: müssen gedämpft werden (wichtig bei best. Detektoren) → Pulsationsdämpfer oderDoppelkolbenpumpen (Gegentakt)
• HPLC - Apparatives: Probenaufgabe „Rheodyne“: druckloses Einbringen der Probe in eine "Probenschleife"(Volumen 1 µl - 2000 µl, exakt reproduzierbar!), mittels MehrweghahnVorrichtung (Probenventil) in Trennsäule gespült
• HPLC - Apparatives: Autosampler Rack mit einer größeren Anzahl an vorbereiteten Probenfläschchen beladen. Roboterarm mit Nadel, sticht durch Gummiseptum in das gewünschte Fläschchen, saugt Probelösung auf und injiziert automatisch über ein Probenventil; Gerät muss entsprechend programmiert werden;ermöglicht unbeaufsichtigte Serienanalysen (z.B. bei Qualitätskontrolle in pharm. Industrie, in diagnostischen Labors, ...)
• HPLC - Säulen Material: meist Edelstahl, innen poliert, ev. glasbeschichtet; Endverschraubung mit Stahlfritte;Stahlkapillare mit Klemmring-Anschluss (z.B. "Swagelok"). Andere Variante: auswechselbare Kartuschen-Säulen aus gehärtetem Spezialglas (kostengünstiger als Edelstahlsäulen) + Kartuschenhalterung aus Stahl (einmalige Anschaffung). SäulenInnendurchmesser: meist ca. 4 mm; präp. HPLC: auch 20 mm und mehrLänge: 5-50 cm; meist 12,5 oder 25 cm (Vorsäulen 2-5 cm)Säulenfüllen: Slurry-Verfahren → entgaste Aufschlämmung des FüllMaterials in geeignetem LM unter hohem Druck eingepresst Montage: in entsprechender Halterung; vorteilhaft: thermostatisierbarerSäulenofen (Trennungen besser reproduzierbar, bes. beiVerteilungschromatographie)
• HPLC - Detektoren prakt. nur kontinuierliche Detektion selektive und unselektive Detektoren unterschiedliche Empfindlichkeiten• UV/vis-Durchflussphotometera) mit konstanter Wellenlängeb) mit variabler Wellenlängec) Diodenarray-Detektor• Fluorimeter• Differentialrefraktometer• Polarograph• Leitfähigkeitsdetektor• Lichtstreudetektor und Weiterentwicklungen• Massenspektrometer• Radioaktivitätsdetektor
• HPLC: UV/vis-Detektor selektiv, nur UV/vis-absorbierende Substanzen erfassbar; trotzdem relativ universell einsetzbar (Detektoren mit variabler Wellenlänge); Nachweisgrenze ca. 10-9 g/ml meist 2-Strahl-Prinzip: Lichtquelle, 2 Strahlen durch Blenden/Linsen-Kombination, Küvetten aus Quarzglas, Photodiode, elektr. Verstärkung; statt (austauschbarem) Filter: Monochromator (stufenlose Selektion der Wellenlänge möglich); Bereich: 200-400 nm (mit Deuteriumlampe), 350-800 nm (mit Wolframlampe) Fließmittel darf beigewählter Wellenlängenicht absorbieren;
• HPLC: Diodenarray-Detektor Weiterwentwicklung des UV/vis-Detektors: viele Wellenlängen gleichzeitig erfasst; zusätzliche Information über substanzspezifische Eigenschaft (UVSpektrum); graphische Darstellung in 3 dimensionaler Matrix; Array = Reihe (hier: Reihe von Photodioden; jede Diode misst Licht einer bestimmten Wellenlänge nach Auffächerung des polychromatischen Lichtstrahls mittels Beugungsgitter) HPLC: Diodenarray-Detektor (1)= heute der Standard-Detektor schlechthin Diodenarray-Detektor auch Aussage über Peakreinheit (= Einheitlichkeit) möglich → Vergleich des UV-Spektrums an ansteigender Peakflanke mit UV-Spektrum an abfallender Peakflanke → müssen bei einem einheitlichen Substanzpeak übereinstimmen (X-Achse: Chromatogramm, Y-Achse: UV-Spektrum)
• HPLC: Fluoreszenz-Detektor höhere Selektivität als UV/vis-Detektor Prinzip: best. Substanzen durch UV-Licht zur Fluoreszenz angeregt (Eigenstrahlung bei höherer Wellenlänge); Messung der Intensität des emittierten Lichtes erfolgt rechtwinkeligzur Richtung der UV-Anregungsstrahlung Nachweisgrenze ca. 10-10 g/ml; ev. Derivatisierung mitfluoreszenzfähigen Reagentien (z.B. Dansylchlorid) → auchVerbindungen erfassbar, die von Haus aus nicht fluoreszieren
• HPLC: Brechungsindex-Detektor unselektiv, dafür universell verwendbar; rel. unempfindlichLichtquelle, Blende/Linse, Referenz- und Messzelle mit schräggestellter Trennwand(Winkel beeinflusst Empfindlichkeit), Spiegel, opt. Nullpunkt, Photodiode Referenzzelle: mit reinem Eluenten gefüllt; genaue Thermostatisierung erforderlich (Brechungsindex ist temperaturabhängig!), kein Gradientenbetrieb möglich; Anwendung: z.B. für Zucker; Nachweisgrenze ca. 10-7 g/ml
• HPLC: Elektrochemischer Detektor Funktionsprinzip Oxidation bzw. Reduktion der detektierten VerbindungenMessung des Stroms (bei elektrochemischer Umsetzung fließt durch dieElektronenübertragung Strom) Vorteile selektivhohe Empfindlichkeit (Nachweisgrenze: 10-11 g/ml) Zusatzinformationen mobile Phase muss gewisse Leitfähigkeit besitzen, ev. Zusatz von Leitsalzen nötig
• HPLC: Leitfähigkeitsdetektor Detektion von Ionen (= Ladungsträger) bei leitender mobiler Phase Messung des Leitwerts (= Reziprokwert des Widerstandes) zwischenzwei parallel angeordneten Elektroden

back  |  next 3 / 6